胚胎神经细胞的培养方法及应用

体外胚胎神经细胞培养与在体神经细胞在神经发育生物学的研究中相辅相承,不断推动神经科学的发展.神经细胞原代培养涉及神经细胞的分离纯化、培养基的成分及观测方法等.本文对国内外近年来胚胎神经细胞的培养方法及应用进行了简单的综述.     

神经上皮干细胞的分离培养及其体外分化特性的观察

目的探讨大鼠胚胎神经管神经上皮干细胞的分离培养条件,并观察其在体外的分化特性.方法采用显微解剖、机械吹打、无血清悬浮培养方法分离培养神经上皮干细胞,采用巢蛋白(nestin)免疫细胞化学染色技术检测神经上皮干细胞,用NSE和GFAP免疫组化染色检测并计数神经细胞和神经胶质细胞.结果大鼠胚胎神经管神经上皮干细胞在无血清培养基中可形成大量呈nestin抗原阳性细胞构成的神经球,经传代有血清培养后分化为NSE阳性和GFAP阳性细胞,其中NSE阳性细胞占细胞总数的47.7%,GFAP阳性细胞占细胞总数的39.8%.结论胎鼠神经管神经上皮干细胞在无血清培养中可增殖和传代,在有血清培养中可分化为神经细胞和神经胶质细胞,两者之比为47.7∶39.8.     

一种获取精确胚胎天数鼠脑皮质神经细胞原代培养方法

目的:探讨获取精确胚胎天数鼠脑皮质神经细胞原代培养方法.方法:首先将性成熟雌雄SD大鼠1∶1合笼于代谢饲养盒内,次日观察有无阴栓(同时做阴道涂片),若有记为E0.取E17孕鼠断颈处死,无菌状态下取出子宫,剥离羊膜与胚外膜,取得胚胎.胚胎断头,在解剖显微镜下用尖镊沿双眼、小脑和脑干腹侧切取大脑皮质,用0.125％胰酶进行温和消化,采用MEM加10％胎牛血清、10％马血清和1％ L-Glutamine混合培养基,用0.73 MPoly-L-Omithine Hydrobromide处理的培养板入37℃,10％CO2孵箱内培养.结果:雌鼠一次可排出阴栓3-5个不等,阴栓为奶黄色、锥体形、质韧.同时做阴道涂片可见活动精子;获取得胚胎脑皮质细胞呈贴壁生长,其胞体饱满,折光性好,突起明显,与周围细胞形成网络连接.结论:用阴栓并精子涂片判断胚胎胎龄简便而准确;E17胚胎适宜体外培养获得脑皮质细胞;组合培养基加处理过的培养板和10％ CO2孵箱浓度的新方法获得了状态良好的脑皮质神经细胞.     

山羊胚胎大脑皮层神经干细胞分离、培养与鉴定

目的 :从山羊胚胎大脑皮层中分离培养并鉴定神经干细胞。方法 :利用NBS培养和单细胞克隆技术在山羊胚胎大脑皮层中分离出具有单细胞克隆能力的细胞 ,并进行培养、传代、分化观察 ,采用免疫组化检测克隆细胞的神经巢蛋白 (Nestin)抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。结果 :从胚龄 2 4～ 30d的新鲜山羊胚胎大脑皮层中成功分离出神经干细胞 ,该细胞具有连续克隆能力 ,可传代培养 ,表达神经巢蛋白抗原。分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论 :山羊胚胎大脑皮层中存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞。     

小鼠胚胎干细胞在单层粘附培养中向神经细胞的分化

目的 :探讨小鼠胚胎干 (ES)细胞在无血清培养基中以单层粘附培养方式向神经分化的方法。方法 :比较ES细胞在不同培养基中的生长情况 ,分析ES细胞在不同时间分化形成神经细胞的比例。结果 :( 1 )DMEM F1 2和Neurobasal B2 7的 1∶1混合培养基最适合ES的生长。 ( 2 )单层粘附的ES细胞表达神经细胞粘附分子 (NCAM)的比例随时间增长而增加 ,而nestin的表达先增加后下降。 ( 3)ES细胞可在两周分化为神经胶质及神经元 ,形成神经网络。结论 :小鼠ES细胞可在单层粘附培养中获得向神经的高效分化。     

NGF 对大鼠胚胎中脑神经细胞体外增殖和分化的影响

目的:探讨神经生长因子(nerve growth factor,NGF)对大鼠胚胎中脑神经细胞体外增殖和分化的影响。方法:在体外分离培养大鼠胚胎中脑神经细胞的培养液中加入不同浓度(10、50、100、200ng/ml)的NGF,培养不同时间,以不加神经营养因子的细胞为对照组,通过MTT法检测细胞活性,神经元特异性烯醇化酶免疫细胞荧光技术鉴定神经细胞,光镜下形态学观察各组大鼠中脑神经细胞体外增殖和分化情况。结果:胚胎中脑神经细胞胞体增大、突起延长且有丰富的神经纤维连结成网络状,细胞集落数增加,显示出剂量-效应关系。结论:一定剂量的NGF能促进大鼠中脑神经细胞分化和增殖,增强其活性。     

诱导胚胎干细胞向神经细胞分化方法的研究与探讨

胚胎干细胞(ES细胞)是一种能够在体外进行不断自我更新,并具有多种分化潜能的细胞。胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的研究进展迅速,相关实验技术和理论也不断发展。总结了近年来各国研究者诱导小鼠和人胚胎干细胞向神经细胞分化的方法,分析了一些方法的原理并初步探讨其相关的分子机制,并提出一些可行性新方法。胚胎干细胞向神经细胞诱导分化因其体外的可操作性、来源的广泛性及质量可控性将有可能成为临床上治疗神经系统疾病的有效方法。     

一种早期胚胎体外培养新方法的建立

建立一种不依赖于液体石蜡的早期胚胎体外培养方法——套皿法,并比较了4种不同处理方法体外培养胚胎的效果。结果显示,采用套皿法进行胚胎培养,盖液体石蜡和不盖液体石蜡皿中的胚胎在各阶段的发育率差异不显著。与套皿法相比,用单皿微滴覆盖法(Brinster法)培养的胚胎在各阶段的发育率显著降低。不覆盖液体石蜡单皿中的胚胎则阻断于二细胞阶段。实验设计的套皿法是一种有效的早期胚胎体外培养方法,为早期胚胎体外培养提供了一种新方法。     

哺乳动物胚胎神经细胞的原代分离性单层培养及其应用

本文综合介绍了哺乳动物胚胎神经细胞的体外原代分离性单层培养(primary dissociated monolayer cultures,简称原代单层细胞培养)的特点与方法及其在体外正常形态、生化与生理等方面的分化发育。对近年来国内外神经及小儿神经科学研究中关于这种培养方法的应用情况也进行了概述并指出其优点及实用中存在的问题。     

冷冻保存大鼠胎脑的体外培养活性观察

大鼠胚胎大脑组织用1mol/L二甲基亚砜(DMSO)作为保护剂,以1℃/分的速率冷冻,至-70℃,在液氮中保存60天后在37℃水浴中快速复温并去除保护剂,然后进行体外培养。结果表明,冻-融后的胎脑组织在55天的体外培养过程中,神经元及其他非神经元细胞逐渐生长分化成熟,具有正常的细胞形态;美兰活体染色、甲酚紫染色和乙酰胆碱酯酶(AChE)染色结果显示,组织中各种细胞的形态和染色反应正常,神经细胞有发达的尼氏体,胆硷能神经元也分化成熟;放射自显影结果显示,培养的组织中50％以上的神经元有高亲和性摄取GABA的功能。这些结果说明,胚胎大脑组织在冻存后其活性在很大程度上能得以维持。     

谷子幼穗培养体细胞胚胎发生的组织学研究

谷子劫穗培养再生植株及体细胞胚胎发生国内已有简报。我们在进行谷子幼穗培养高频率诱导胚性愈伤组织及再生植株的同时,利用组织学、解剖学及扫描电镜方法观察到了谷子幼穗培养中的体细胞胚胎发生,为进一步开展谷子原生质体培养及其抗性突变育种奠定了基础。本文着重报道谷子幼穗培养中体细胞胚胎发生的组织学观察结果。     

小鼠胚胎神经干细胞的分离培养及其鉴定

且的探索小鼠胚胎神经干细胞的体外培养方法,并获取高纯度的神经干细胞,为神经干细胞的深入研究提供实验材料。方法无菌条件下分离E15天小鼠胚脑皮质,制成单细胞悬液,在bFGF和B27存在的培养基中培养扩增,通过免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向。结果培养的部分细胞在B27和bFGF存在的无血清培养基中可以在体外分裂增殖,同时表达神经干细胞特异性抗原nestin,并在撤出B27和bFGF的有血清培养基中向神经细胞和胶质细胞分化。结论小鼠胚脑皮质存在具有多向分化潜能的神经干细胞,这些细胞可以在体外稳定培养、传代并自然分化,为细胞替代治疗提供了理想的细胞来源。     

胚胎干细胞的分离与培养

如何分离胚胎干细胞，并在体外进行分化抑制培养，仍是探索性很强的研究课题，本文简述了胚胎干细胞分离培养方法的主要进展与趋势。     

神经干细胞分离培养方法的介绍

在成体的许多组织中发现了多能干细胞,这些干细胞可以进行自我复制,参与组织的正常修复。神经干细胞在体外能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,并具有多向分化潜能。成体神经干细胞和胚胎干细胞都能分化成成体神经系统中的各种神经细胞。神经干细胞具有自我更新能力,因此神经干细胞可以应用于神经损伤或者神经疾病的修复。本文概述了神经干细胞体外分离培养的方法及其生长影响因子。     

小鼠胚胎干细胞的培养

目的:建立小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)的培养方法。方法:制备G418抗性的原代小鼠胚胎成纤维细胞,经丝裂霉素C处理后成滋养层细胞,将小鼠胚胎干细胞复苏后,应用含白血病抑制因子的ES细胞培养液,培养小鼠ES细胞,观察集落的生长情况,并在光镜下观察细胞形态。结果:小鼠胚胎成纤维细胞生长良好,ES细胞呈克隆状生长,且保持未分化状态。结论:建立了小鼠胚胎干细胞培养的有效方法,为下一步基因打靶奠定基础。     

不同方法纯化体外培养脊髓神经元的比较

研究和比较三种不同纯化神经元的方法,以便提供一种纯化效率较高的纯化技术,神经细胞取自于胚胎12－14天小鼠脊髓,应用药物法、差速贴壁法、磁珠包被抗体反应法对神经元进行纯化,然后用NSE免疫组化反应和NSE－ELISA法比较三种不同纯化方法在不同培养时间24、36、48、60、72、84hrs得以神经元的纯度和显示其数目的OD值。结果发现,磁珠包被抗体反应法神经元的纯度随着培养时间的延长纯度可达95％以上,而差速贴壁法所得神经元在培养24hrs后呈现下降趋势,72hrs后可达60％,药物法则阳性神经元比较稳定,但纯度较低,一旦停药,则呈现下降趋势84hrs后达到56％左右。     

山羊体外受精胚胎序贯培养的研究

目的：根据早期胚胎不同发育阶段的营养需求设计体外培养体系,以建立适于山羊早期胚胎体外发育的序贯培养方法。方法：对屠宰场来源山羊卵巢卵母细胞进行体外成熟和体外受精后移入添加不同胚胎发育影响因子的培养体系中进行体外培养,显微镜观察、统计各阶段胚胎发育情况,并对培养的胚胎进行移植。结果：BSA和EGF对山羊体外受精卵具有明显促卵裂作用,培养系统中添加EGS、EGF、HTAU或p—Me可有效支持8-细胞期山羊胚胎克服发育阻滞而提高桑葚胚发育率;在不同胚胎期添加各发育影响因子进行序贯培养的卵裂率、≥8-细胞率和桑葚胚发育率分别为45．2％、60．6％和23．4％,序贯培养的胚胎移植后产羔率为11．1％。结论：宜根据早期胚胎各时期代谢特点和营养需求对山羊胚胎进行序贯培养。     

人参皂甙Rb3对大鼠海马神经细胞谷氨酸损伤作用及相关机制的研究

目的：利用原代培养的海马神经细胞,研究人参皂甙Rb3对谷氨酸兴奋性神经毒性的保护作用及有关机制。方法：采用原代培养的胚胎大鼠海马神经细胞谷氨酸毒性模型,观察人参皂甙Rb3对神经细胞形态、神经细胞活性、细胞外液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）的漏出率及总一氧化氮合酶（nitrogen oxide synthase,NOS）、结构型N0s、诱导型NOS活性等的影响。结果：人参皂甙Rb3对神经细胞的谷氨酸毒性损伤具有保护作用。使细胞形态保持完整,活力增加,细胞膜损伤减轻;而且人参皂甙Rb3能增加神经细胞的结构型NOS活性。降低诱导型NOS的活性。结论：人参皂甙Rb,具有抗谷氨酸兴奋性毒性作用,其作用机制可能与降低诱导型NOS活性。增加结构型NOS的活性有关。     

敲除Pofut1不影响胚胎干细胞向神经元分化

蛋白O-连接岩藻糖基转移酶1 (Pofut1)基因缺失可导致Notch分子无法与配体结合并启动信号传递. 为研究Pofut1基因对哺乳动物胚胎干细胞（ESC）向神经分化的影响,利用Pofut1基因敲除的胚胎干细胞与野生型胚胎干细胞,经体外培养诱导拟胚体（EB）分化为神经细胞,计数分化为神经细胞的比例,采用细胞免疫组化染色和real-time PCR等方法,分析神经细胞特异性标志分子的表达. 结果显示,Pofut1基因缺失后,对EBC生长没有明显影响,分化过程中形成的拟胚体数量明显增多,分化的神经样细胞以及神经标志物分子的表达也明显多于对照组;Notch信号缺失对小鼠胚胎干细胞生长无明显影响,但可以促进ES细胞向神经细胞分化.     

诱导性多能干细胞向神经细胞分化的研究进展

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS cell)是通过转染外源特定的基因组合来诱导成体细胞重编程为类似于胚胎干细胞的一种多潜能干细胞,iPS细胞与胚胎干细胞不仅在形态上相似,而且在功能方面几乎相同.另外,iPS细胞的诞生克服了胚胎干细胞在临床应用时涉及的移植免疫排斥与伦理道德问题,因此具有重要的临床应用价值.目前iPS在治疗中枢神经系统性疾病方面的研究已取得很大进展,包括iPS细胞向神经细胞诱导分化方法的改进、分化机理的探索以及iPS细胞分化来源神经细胞在神经系统疾病模型中治疗作用的研究等.从iPS细胞的创建及特点、iPS细胞向神经细胞分化的诱导方法及研究新进展方面予以综述.