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1.
汉坦病毒陈株S基因编码区的克隆,序列分析及表达 总被引:1,自引:0,他引:1
从汉坦病毒陈株感染的VeroE6细胞裂解液中提取病毒RNA,经逆转录PCR获得病毒S基因编码区约1.3kbcDNA片段,克隆该片段后进行核苷酸序列测定,并与汉坦病毒76118株进行同源性比较,结果二者核苷酸序列同源性为86%,推导的氨基酸序列同源性为97%。将该基因片段插入原核表达载体pGEX4T1,在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物为GSTNP融合蛋白。SDSPAGE检测表达蛋白分子约72kD左右。Westernbloting和ELISA试验结果表明,表达产物可与多株抗汉坦病毒核蛋白的McAb发生反应,其抗原表位及McAb反应谱与76118株相比存在某些差异。 相似文献
2.
海藻糖合酶基因的克隆及其植物表达载体的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
以担子菌灰树花的菌丝体中提取总RNA,并纯化出mRNA,mRNA经反转录合成cDNA第一链,以cDNA第一链为模板经PCR扩增海藻糖合酶(Tsase)基因,获得一长约2.2kb的片段,把该片段连接一pGEM-T-easy vector上进行测序,其全长共2199bp。随后将此片段以正向插入植物表达载体pBI121的HindⅢ+Xbal位点构建pUB,再把海藻糖合酶基因以正向插入载体pUB的BamH 相似文献
3.
从端粒酶活性呈性阳的水生细胞株人肺SCP-A-1中分离了总RNA,以此为模板,结合RT-PCR技术和长模板PCR技术,用hTERT基因特异性引物扩增到一长约2.2kb的cDNA片段。将该片纯化后克隆到通用测序本T-easy vector上得到重组质粒。用测引物SP6和T7对该片段进行部分双向测序。经序列分析和同源比较推测该片段包含了hTERT基因的第3内含子。该结果提示了RT-PCR技术和长模板P 相似文献
4.
通过有机试剂抽提,CF-11纤维素柱层析,从感染水稻齿叶矮缩病毒菲律宾分离株(RiceRaggedStuntVirus,Philippineisolate,简称RRSV-P)的水稻植株中获取该病毒的全基因组,即获得从Segment1到Segment10(S1-S10)的10条双链RNA(dsRNA),然后设计合适的引物,用RT-PCR方法得到S9的cDNA并将其克隆到pUC119质粒上扩增,以双链测序法测定该cDNA的全序列。同时又将此cDNA克隆到大肠杆菌表达质粒pGEX-3X上,在大肠杆菌菌株DE3中用IPTG诱导表达,经超声波破菌、离心、Glutathione-sepharose4B亲和层析,得到纯化的分子量为64kD的融合蛋白。 相似文献
5.
根据已发表的序列,分别在鸡贫血病毒(CAV)环形基因组DNA(全长2.3kb)的EcoRI位点和BamHI位点的两侧选择适当序列合成两对引物,用PCR技术,从斑点杂交检测到病毒核酸的CAV感染的MDCCRP1细胞基因组DNA中,分别扩增出包含EcoRI和BamHI分割开的病毒基因组两部分(1.5kb和0.8kb)约1.5kb和约1.25kb的两个片段。再将其中相应序列拼接克隆进pUC18载体,获得包含CAV全基因组序列DNA片段的克隆质粒pCAV2.4。酶切分析表明,该质粒具有预期的BamHI位点、PstI位点、HindⅢ位点,而预期的EcoRI位点消失。重组质粒插入DNA片段的两端序列分析表明,质粒pCAV2.4是包含CAV全基因组序列的重组质粒,插入DNA片段序列中的EcoRI位点序列发生了一个碱基突变。 相似文献
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人GM—CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
从诱导的人胚肺细胞HFL株中提取总RNA.经RT-PCR反应获取了人GM-CSFcDNA,DNA序列测定表明其顺序与文献报道完全一致。为了获得高效表达,应用PCR改造了人GM-CSF的cDNA5’端核苷酸序列,并将改造的人GM-CSF基因插入含T7启动子的质粒pET-11d构建成表达质粒pETC-5,将此质粒转化大肠杆菌株BL21(DE3)得到表达菌株BLEC4。表达菌株用0.5mol/LIPTG诱导2小时后,产生大量重组蛋白并形成包涵体。SDS—PAGE电泳图谱扫描结果表明,rhGM-CSF产量占菌体总蛋白量的16%。ELISA和TF-1细胞培养测定表明,初步纯化和复性的rhGM-CSF具有天然的hGM-CSF生物活性。 相似文献
8.
HCV5′端非编码区cDNA的体外转录 总被引:1,自引:0,他引:1
采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从广东省一例慢性丙型肝炎病人血清中获得丙型肝炎病毒(HCV)5′端非编码区(5′NCR)302bp的cDNA片段,经补齐和提纯后插入pUC19质粒,获得的重组体pUN进行序列测定,将pUN的目的基因亚克隆进体外转录载体pSPORTI多克隆位点的EcoRffI和PstI切点之间,所得重组体pSN线性化后由T7RNA多聚酶及SP6RNA多聚酶引导体外转录反应,产物 相似文献
9.
A组轮状病毒SA11VP6基因的克隆和表达 总被引:4,自引:0,他引:4
从SA11VP6基因全序列克隆开始,设计一对两端带有酶切位点的引物,逆转录PCR扩增出VP6全基因CDNA。经酶切后插入PUC19,构建了VP6全基因克隆PRA6。再经酶切后插入痘苗病毒载休质凿PJSA1175中。利用Lipofectin导入TK143细胞,利用TK基因和Lac基因作为重组病毒的筛选标记。表达产物用单克隆抗体ELISA法检测,发现细胞培养上清和细胞裂解液都是阳性。Western b 相似文献
10.
采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从广东省一例慢性丙型肝炎病人血清中获得丙型肝炎病毒(HCV)5'端非编码区(5'NCR)302bp的cDNA片段,经补齐和提纯后插入pUC19质粒,获得的重组体pUN进行序列测定。将pUN的目的基因亚克隆进体外转录载体pSPORTI多克隆位点的EooRI和PstI切点之间,所得重组体pSN线性化后由T_7RNA多聚酶及SP6RNA多聚酶引导体外转录反应,产物经凝胶电泳及特异引物RT-PCR,证实SP6引导的是正义RNA,T7合成的是反义RNA,其大小分别力429bp和362bp。并证实所得RNA力HCV5'NCRcDNA转录而来。获得的HCV5'NCRcDNA和RNA在常规逆转录和PCR步骤中用于设立有效的模板对照,对消除假用性及评估试剂有重要意义。同时,HCV5'NCR体外转录载体的构建可用于制各RNA探针和反义RNA,改进后还可作为定量PCR的竞争性模板。 相似文献
11.
以中国春小麦幼苗为材料,利用改进的mRNA差异显示方法和银染技术,对不同低温驯化诱导表达的差异基因进行分离,共得到cDNA差异片段60条.经Reverse Northern验证,检出阳性表达片段8条,克隆并测序,分别命名为TIGW1~TIGW8.其中,TIGW2和TIGW3可能与抗冻蛋白积累、低温诱导蛋白的生成或低温信号的感受与传递有关;TIGW1、TIGW6、TIGW8中具有ACGT应答元件,TIGW3含有CAACA应答元件,说明可能获得了冷诱导基因的启动子序列. 相似文献
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辣椒温和斑点病毒(PMMV)外壳蛋白基因的克隆和序列测定 总被引:3,自引:0,他引:3
从本院分离的辣椒温和斑点病毒株系PMMV-QD中提取RNA.根据已有报道的外壳蛋白(CP)自行设计引物P1、P2,用RT-PCR扩增PMMV-QD的CP基因的cDNA,插入pMD 18-T载体,转化感受态受体菌XL1-B1ue,以蓝白菌落筛选转化株,用PCR检测白色菌落,确认获得了含cDNA的阳性重组子.序列测定和比较的结果表明该片段确含有PMMV的CP基因编码区,此种cDNA与国外报道的PMMV病毒株系核苷酸序列的同源性达到97.7%. 相似文献
14.
目的:试图分离和克隆小麦Rubisco活化酶cDNA片断并构建反义表达载体。方法:采用RT-PCR技术克隆cDNA片断,对序列用Blast等软件进行分析,并将该片断反向连接于植物表达载体pROK2的CaMV35S启动子下游,构建反义表达载体。结果:获得了小麦Rubisco活化酶(RCA)的cDNA片断(GenBank注册号:DQ984669);小麦RCA的cDNA片断推导的氨基酸序列与其它植物的RCA氨基酸序列高度同源。序列比较表明,用本实验所得的cDNA序列推导出的氨基酸序列与GenBank登录的大麦(AAA63163)、南极银须草(AAP83928)、水稻(AAX95414)、玉米(AAC97932)、拟南芥(NP 850321)和烟草(CAA78703)等的RCA序列的同源性分别为97%、95%、88%、83%、82%和82%;分析表明,该序列为新的小麦RCAα的cDNA序列;通过选择和引入合适的酶切位点进行载体构建,构建了小麦RCA的cDNA反义表达载体pR-AntiRCA。结论:构建成了小麦RCA的cDNA反义表达载体。 相似文献
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鹅源新城疫病毒拯救体系的建立 总被引:1,自引:0,他引:1
参照GenBank上公布的鹅源新城疫病毒ZJI株全序列,设计8对引物,经RT-PCR法从尿囊液中扩增目的片段后,分别克隆进pCR2.1载体,将Ⅰ~Ⅶ7对引物的扩增片段依次亚克隆到TVT7R转录载体中,构建了含NDV全基因组cDNA的转录载体(pNDVZJI),将Ⅴ、Ⅵ和Ⅷ3对引物的扩增片段分别克隆进pCR2.1载体,并亚克隆到表达质粒pCI-neo上,构建了L基因的真核表达载体(pCI-L),pNDVZJI、pCI-L与另外两个辅助表达质粒(pCI-NP和pCI-P)共转染BSR-T7/5细胞,成功拯救出了具有血凝性的鹅源新城疫病毒,ZJI株鹅源新城疫病毒的成功拯救为后续相关研究工作的开展打下了基础。 相似文献
16.
山羊卵泡刺激素β-亚基cDNA的分子克隆与序列分析 总被引:2,自引:0,他引:2
从新屠宰的母山羊脑垂体中提取总RNA,反转录获得cDNA,以皮cDNA为模板用PCR法扩增目的片段,获得长为390bp的山羊卵泡刺激素β-亚基cNDA片段,与预期的目的片段大小一致。将它克隆至pMD-18-T-Verctor中,随机挑选2个阳性重组子进行测序,并将测序结果与绵羊,牛等多种哺乳动物该基因的核苷酸序列及相应氨基酸序列进行比较。结果表明,山羊的卵泡刺激素β-亚基因与绵羊的该基因氨基酸同源性最高,达99.9%,只有1个氨基酸不同,与牛,猪,马,虎,人,大鼠的该基因氨基酸同源性分别为92.5%,91.7%,89.9%,89.1%,86.0%,83.7%。从核苷酸同源性来看,山羊的卵泡刺激素β-亚基因与绵羊该基因的同源性了高,达98%;与牛,猪,马,虎,人,大鼠的核苷酸同源性为95%,90%,90%,88%,86%,84%。结果表明,尽管β-亚基基因有种的特异性,但在哺乳动物中其同源性还是很高的。 相似文献
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采用原核表达系统pET-32a( )载体和BL21trxB(DE3)菌株对两条茶树β-葡萄糖苷酶基因cDNA(GluⅠ和GluⅡ)进行了表达,研究了不同诱导时间、不同诱导温度对两个茶树β-葡萄糖苷酶表达量的影响并测定了两者的活性。表达分析结果表明,诱导6h、25℃时,GluⅠ在总蛋白中所占比例最高;诱导6h、37℃时,GluⅡ在总蛋白中所占比例最高,活性测定结果表明,两种表达蛋白均具有正常的β-葡萄糖苷酶活性,在相同的测定条件下,GluⅡ活性(0.310±0.03U·ml-1)比GluⅠ(0.234±0.03U·ml-1)活性更高。 相似文献
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应用从EST出发克隆基因家族新成员的策略 ,在人类睾丸组织cDNA文库中分离出 1个新的全长cDNA片段 ,它编码的蛋白产物与 (UDP 半乳糖苷 :N 乙酰基葡萄糖胺 )半乳糖苷转移酶 (GalT)有较高的同源度 .分析表明 ,在其 2 173bp的序列中含有 1个长 10 3 2bp的开放读框 ,编码 3 44个氨基酸 .基于该基因与半乳糖苷转移酶基因家族各成员的同源关系 ,尤其是与G .gallus β 1,4 半乳糖苷转移酶Ⅰ型(CKⅠ )的关系密切 ,这个基因的蛋白产物被命名为人类 β 1,4 半乳糖苷转移酶同源蛋白Ⅰ型 .Northern杂交发现它在被检测的人体 16种组织中均有表达 ,但丰度各异 .通过与含人单条染色体的人 /啮齿类的杂种细胞DNA进行Southern杂交 ,证明该基因位于 3号染色体上 . 相似文献