洛氏脊漠甲抗冻蛋白基因的克隆、表达和功能检测

为了研究抗冻蛋白基因是否在新疆荒漠昆虫洛氏脊漠甲 Pterocoma loczyi 中存在,利用 RT-PCR 技术克隆获得了洛氏脊漠甲抗冻蛋白的 cDNA 片段,命名为 Plafp743。测序结果表明洛氏脊漠甲 Plafp743 所编码的蛋白质由 94 个氨基酸组成,蛋白序列呈现规则结构 CTX₁X₂X₃X₄CX₅X₆X₇X₈X ₉。利用原核表达载体构建重组质粒 pGEX-4T-1-Plafp743,转化 Escherichia coli BL21 进行融合蛋白表达,SDS-PAGE 结果表明抗冻蛋白PLAFP基因以可溶性融合蛋白形式表达,相对分子质量 36 kD。用 Glutathione Sepharose 4B 亲和柱对表达蛋白进行纯化后,通过赤翅甲 Dendroides canadensis 抗冻蛋白的小鼠抗血清进行 Western blot 分析,结果表明纯化的 GST-PLAFP 融合蛋白与赤翅甲抗血清能够发生特异性的免疫反应。大肠杆菌的低温抗冻保护实验结果证明,30 μg/mL 的 GST-PLAFP 在-6℃ 对细菌具有显著的保护作用,且随着抗冻蛋白浓度的增加,抗冻保护作用的效 果也随之增加。本研究首次报道了从荒漠昆虫洛氏脊漠甲扩增得到抗冻蛋白基因,提示抗冻蛋白可能是荒漠昆虫普遍采取的过冬生存策略,为进一步开发利用昆虫抗冻蛋白奠定了基础。     

准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白MPAFP5毕赤酵母表达产物的理化性质

研究准噶尔小胸鳖甲Microdera punctipennis dzhungarica Kasz抗冻蛋白MPAFP5真核表达产物的功能及理化性质。首先用硫酸铵浓度梯度沉淀初步纯化酵母真核表达产物,然后通过细菌低温保护实验检测抗冻蛋白MPAFP5低温保护功能,同时探讨抗冻蛋白MPAFP5在酸碱环境和100℃时的稳定性,并通过等电聚焦凝胶电泳检测其等电点。研究表明MPAFP5真核表达产物在低温下能够提高细菌的存活率,能够耐受高温和一定程度的强酸强碱,其等电点约为5.8左右。准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白MPAFP5真核表达产物与赤翅甲抗冻蛋白(DAFP)的比较表明拟步甲类昆虫抗冻蛋白具有相似的理化性质。     

新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因的克隆和抗冻活性分析

根据GenBank中已发表的昆虫抗冻蛋白基因的保守序列设计引物,利用RT-PCR技术结合3'-RACE扩增的方法,从新疆荒漠昆虫准噶尔小胸鳖甲 Microdera punctipenis dzunarica中获得了长约294 bp不含信号肽的抗冻蛋白cDNA片段,命名为MpAFP5,其全长序列为363 bp(GenBank注册号为：AY821792)。基因测序结果表明, MpAFP5-cDNA片段与加拿大拟步甲Dendroides canadensis AFP 8基因片段、黄粉甲Tenebrio molitor THP 4-9基因片段的核苷酸同源性分别达68.4%和71.8%,氨基酸序列同源性分别达70%和81%。将MpAFP5构建到原核表达载体pGEX4T-1中,重组质粒pGEX4T-1-MpAFP5在大肠杆菌BL21(DE3)中能够表达融合抗冻蛋白,SDS-PAGE分析显示融合蛋白的分子量约为37 kD,Western印迹分析证明MpAFP5在大肠杆菌中正确表达。细菌的抗冻实验结果显示准噶尔小胸鳖甲融合抗冻蛋白对细菌具有显著的抗冻保护作用,保护效果与抗冻蛋白剂量呈正相关性。     

美洲拟蝶抗冻蛋白基因在E. Coii中表达的研究”

y.文阐述了美洲拟蝶抗冻蛋白基因在E. coli中表达的研究。用Hpa II酶切pCT5质片价晰 出抗冻蛋白基因片段,再经Bal引酶、绿豆核酸酶处理,井连接＿｛：Bgl 11接头,插人到、>RF-2龙达嘴 粒的B川II位点上,筛选出正确插入方向的转化子,称pORF-AF。并对pORF-AF质粒作昌部分限制 性酶切图谱,测定出插入基因的DNA序列,同时用SDS-聚丙烯队胺凝胶电泳分析检测插人基因,在 E. coli TK1046中的表达产物,发现布电泳图谱上有明显的融合蛋白带,分子是大于标准蛋i 一半乳 糖普酶是由大肠杆菌外膜蛋白F、抗冻蛋白和0-半乳糖营酶组成。融合蛋白含量占粉,的菌体提取蛋 白20％ 左右。     

准噶尔小胸鳖甲融合抗冻蛋白活性的比较研究

为了比较准噶尔小胸鳖甲Microdera punctipennis dzhungarica原核表达的不同融合抗冻蛋白活性是否存在差异,分别利用重组表达质粒pGEX-4T-1-Mpafp5和pMAL-p2x-Mpafp5在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达融合抗冻蛋白GST-MpAFP5和MBP-MpAFP5,并利用亲和层析纯化蛋白。SDS-PAGE分析结果证明获得了两种高效表达纯化的GST-MpAFP5和MBP-MpAFP5融合蛋白。在浓度为0.5 mg/mL时,两种蛋白的热滞值分别为0.51℃和1.336℃,其溶液冰晶形态均为棱型。抗冻保护实验结果显示： 准噶尔小胸鳖甲两种融合抗冻蛋白均能够显著提高细菌在低温下的存活率,并且MBP-MpAFP5对细菌的保护效果显著高于GST-MpAFP5。研究结果对于准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白的应用具有重要的理论意义。     

美洲鲽抗冻蛋白基因的克隆及在E.coli中的表达

本文报告了美洲鲽抗冻蛋白基因的克隆及在E.coli中表达的研究,以质粒P~(CT5)作为抗冻蛋白基因的供体,p~(ORF-2)作为表达载体。用HpaⅡ酶从质粒p~(CT5)上切下抗冻蛋白基因片段,再经Bal 31酶,绿豆核酸酶处理,连接上BglⅡ接头,然后插入到p~(ORF-2)的BglⅡ位点上,借助于p~(ORF-2)上的β-半乳糖苷酶基因的活性,使含正确插入抗冻蛋白基因的克隆呈现出蓝色菌落,共获得4000多个转化子,其中有201个蓝色克隆。对于50个蓝色克隆提取质粒DNA,电泳后发现均大于p~(ORF-2)。用BglⅡ消化后,可以发现有300—1500bpDNA片段,同时确定了抗冻蛋白基因在p~(ORF-2)中的插入方向,对于正确插入的克隆作出部分限制性内切酶图谱,测定出插入的抗冻蛋白基因片段的DNA序列,然后将重组质粒从E.coli MH1000菌株转化到E.coliTK1046中,研究分析表达产物,SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳结果证明插入的抗冻蛋白的基因已表达,有明显的融合蛋白带,分子量大于β-半乳糖苷酶、是由大肠杆菌的外膜蛋白F,抗冻蛋白和β-半乳糖苷酶组成。融合蛋白含量占总蛋白的20％左右。     

新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的：利用酵母Pichia pastoris蛋白表达系统,表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白。方法：根据新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白(MPAFP5)基因序列设计引物,并分别在5’引物和3’引物中引入了EcoRI和SalI酶切位点,经PCR扩增MPAFP5基因成熟肽序列后与pGEX4T-1载体相连,再将MPAFP5从pGEX4T-1载体上切下亚克隆至穿梭质粒pGAPZαA上,获得的重组穿梭质粒pGAPZαA-MPAFP5,经线性化后采用电转化法将重组穿梭质粒转入酵母细胞SMD1168内,Zeocin^ 筛选鉴定重组子,小瓶发酵后取上清作SDS-PAGE检测,并用Western-blot检测表达蛋白的正确性。结果：MPAFP5成功地在酵母表达系统获得表达,Western-blot检测表明表达产物为准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白。结论：酵母表达系统能够高效表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白,为高密度发酵大量生产抗冻蛋白奠定了基础。     

Tenebrio molitor抗冻蛋白基因家族cDNA片段的克隆、序列分析及原核表达

利用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)的方法, 克隆黄粉甲虫(Tenebrio molitor)抗冻蛋白基因cDNA片段并进行序列分析和原核表达。同源性分析表明, 获得9条新cDNA片段, 与黄粉甲虫抗冻蛋白基因家族的其他基因序列具有较高的同源性。重组质粒pGEX-4T-1-tmafp-XJ430, 转化E.coli BL21进行原核表达, SDS-PAGE分析结果表明, 抗冻蛋白基因以可溶性融合蛋白表达, 相对分子量为38 kDa。构建真核表达载体pCDNA3-tmafp-XJ430, 免疫小鼠, 获得的抗血清滴度为1:2 000。Western blotting 结果为单一的条带, 证明该抗血清具有针对抗冻蛋白TmAFP-XJ430抗原的专一性。     

黄粉虫不同抗冻蛋白基因家族成员的低温应激表达

黄粉虫Tenebrio molitor L.抗冻蛋白基因家族有多个成员,其氨基酸数量和蛋白结构存在差异。尽管有报道发现冷驯化后这些抗冻蛋白的表达量会升高,但不同家族成员是否存在功能分化尚不清楚。本研究中,检测了冷驯化对低温死亡率的效应和对不同类型的抗冻蛋白家族成员基因表达量的影响。结果表明,冷驯化可以显著降低黄粉虫幼虫的低温死亡率和提高不同类型抗冻蛋白基因的表达量。其中,长的抗冻蛋白和低温死亡率的相关关系最为明显。说明不同的抗冻蛋白家族成员的功能有明显的分化,为进一步理解抗冻蛋白的活性和利用抗冻蛋白提供了新的认识。     

抗菌肽Pexiganan和IB-367的基因克隆及表达

目的:为开发新的抗菌药,通过基因工程手段获得能够表达抗菌肽Pexiganan和IB-367的工程菌株。方法:人工合成2种抗菌肽Pexiganan和IB-367基因,构建相应的GST融合表达载体,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆,通过SDS-PAGE和Western印迹验证目的蛋白的表达。结果:获得了2株分别表达Pexiganan-GST融合蛋白和IB-367-GST融合蛋白的工程菌株。结论:通过基因工程方法,可以融合蛋白的形式获得小分子多肽Pexiganan和IB-367。     

Cloning, sequencing and prokaryotic expression of cDNAs for antifreeze protein family from beetle Tenebrio molitor

Partial cDNA sequences coding for antifreeze proteins in Tenebrio molitor were obtained by RT-PCR.Sequence analysis revealed nine putative cDNAs with a high degree of homology to Tenebrio molitor antifreeze protein genes published in GenBank.The recombinant pGEX-4T-l-tmafp-XJ430 was introduced into E.coli BL21 to induce a GST fusion protein by IPTG.SDS-PAGE analysis for the fusion protein shows a band of 38 kDa.pCDNA3- tmafp-XJ430 was injected into mice to generate antiserum which was later detected by indirect ELISA.The titer of the antibody was 1:2000.Western blot-ting analysis shows that the antiserum was specifically against the antifreeze protein.Our results laid the founda-tion for further studies on the properties and functions of insect antifreeze proteins.     

HCV包膜蛋白E2的克隆、表达与检测

构建丙型肝炎HCV包膜蛋白糖蛋白的E2基因原核表达载体,获得大量重组HCVE2蛋白,进行E2蛋白的抗原性及潜在保护作用研究。通过RT-PCR从HCVRNA阳性血清标本中扩增出975bp(383～708)E2基因片段,PCR产物经EcoR I和Sall I双酶切后连接到经同样酶切的PET-41a原核表达载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经Amp筛选,得到阳性重组质粒PET41a-HCVE2菌株,并以IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE鉴定,表达产物经固定化金属配体亲和层析纯化,用ELLSA方法检测生物学活性。结果表明,构建的HCVE2包膜蛋白基因片段原核表达质粒所表达产物主要以包涵体形式存在,表达的融合蛋白与HCV阳性血清具有较好的反应原性。以HCVE2融合蛋白检测患者阳性血清具有良好的抗原性,有望能提高HCV抗体检测试剂盒的检出率。     

Expression and purification of the SsbB protein from Streptococcus pneumoniae

The Gram positive bacterium, Streptococcus pneumoniae, has two genes, designated ssbA and ssbB, which are predicted to encode single-stranded DNA binding proteins (SSB proteins). We have shown previously that the SsbA protein is similar in size and in biochemical properties to the well-characterized SSB protein from Escherichia coli. The SsbB protein, in contrast, is a smaller protein and has no counterpart in E. coli. This report describes the development of an expression system and purification procedure for the SsbB protein. The ssbB gene was amplified from genomic S. pneumoniae DNA and cloned into the E. coli expression vector, pET21a. Although, we had shown previously that the SsbA protein is strongly expressed from pET21a in the E. coli strain BL21(DE3)pLysS, no expression of the SsbB protein was detected in these cells. However, the SsbB protein was strongly expressed from pET21a in the Rosetta(DE3)pLysS strain, a derivative of BL21(DE3)pLysS which supplies the tRNAs for six codons that are used infrequently in E. coli. The differential expression of the two SSB proteins in the parent BL21(DE3)pLysS strain was apparently due to the presence of two rare codons in the ssbB gene sequence that are not present in the ssbA sequence. Using the Rosetta(DE3)pLysS/pETssbB expression system, a protocol was developed in which the SsbB protein was purified to apparent homogeneity. DNA binding assays confirmed that the purified SsbB protein had single-stranded DNA binding activity. The expression and purification procedures reported here will facilitate further investigations into the biological role of the SsbB protein.     

人乳头瘤病毒16型E7蛋白的原核表达与鉴定

本研究在大肠杆菌BL21中融合表达人乳头瘤病毒16型E7蛋白,并初步评价其应用价值。采用PCR技术扩增出HPV16E7基因,将其克隆进原核表达载体pGEX6p-1,转化至大肠杆菌BL21,利用IPTG进行诱导表达。以纯化的融合蛋白作为检测抗原建立间接ELISA方法,用于检测重组李斯特菌(Lm1-2-E7)免疫小鼠后的E7血清抗体水平。在25℃,0.5mM IPTG诱导下,HPV16E7蛋白在大肠杆菌BL21中获得表达,融合蛋白以可溶性形式存在,Western blot结果显示其与HPV16E7单克隆抗体发生特异性反应。二次免疫后小鼠血清经间接ELISA结果表明E7特异性抗体滴度为1∶200。结果表明GST-E7融合蛋白具有较强的免疫活性。     

以重组P-gp为抗原建立检测MDR 1抗体间接ELISA方法的研究

目的:构建MDR 1基因原核表达质粒,表达P-gp重组蛋白,建立检测MDR1抗体的间接ELISA方法。方法:利用重组PCR技术扩增MDR 1基因的1kb片段,克隆至pET-28b（＋）中,构建原核表达质粒pETP-gp,转染感受态菌BL21（DE3）和BL21（DE3）plyss;以E.coli高效表达的P-gp基因主要抗原编码区重组蛋白为抗原,以HRP标记的兔抗人IgG为二抗,建立间接ELISA检测方法。结果:正确构建了pETP-gp原核表达质粒,并可在E.coli中高效表达,表达蛋白可用作检测MDR 1抗体ELISA抗原。结论:成功表达出重组蛋白P-gp,建立了检测MDR 1抗体的间接ELISA方法。     

Phylogenetic analysis and heterologous expression of surface layer protein SlpC of Bacillus sphaericus C3-41

The surface layer protein encoding genes from five mosquito-pathogenic Bacillus sphaericus isolates were amplified and sequenced. Negative staining of the S-layer protein extracted from the cell wall of wild-type B. sphaericus C3-41 was prepared. It showed a flat-sheet crystal lattice structure. Two genes encoding the entire and N-terminally truncated S-layer protein (slpC and DeltaslpC respectively), were ligated into plasmid pET28a and expressed in Escherichia coli. SDS-PAGE revealed that about 130 KD and 110 KD proteins could be expressed in the cytoplasm of recombinant E. coli BL21(pET28a/slpC) and E. coli BL21(pET28a/DeltaslpC) respectively. Furthermore, an intracellular sheet-like or fingerprint-shape structure was investigated in two recombinant strains, which expressed SlpC and DeltaSlpC protein respectively, by ultrathin microscopy study, but bioassay results suggested that the S-layer protein of wild B. sphaericus C3-41 and recombinant E. coli BL21 (pET28a/slpC) have no direct toxicity against mosquito larvae. These results should provide information for further understanding of the function of S-layer protein of pathogenic B. sphaericus.     

冠状病毒HcoV-229E S1蛋白的原核表达及鉴定

目的克隆表达冠状病毒HcoV-229E S1基因片段,表达S1蛋白。方法合成冠状病毒HcoV-229ES1蛋白特异性基因片段并克隆入pET21a原核表达载体,转化BL21（DE3）菌,经IPTG高效诱导表达得到重组蛋白,用金属螯合亲和层析纯化,并通过Western blot对表达的重组蛋白进行鉴定。结果获得了主要以包涵体形式存在的目的蛋白,Western blot鉴定其为S1基因片段蛋白。结论成功构建了HcoV-229E S1蛋白的表达载体,并在BL21（DE3）中得到了高效表达,为下一步表达蛋白免疫原性及疫苗抗病毒保护性测定打下了基础。     

鲍曼不动杆菌铁蛋白的抗氧化功能研究

【目的】克隆鲍曼不动杆菌铁蛋白(Abferritin)基因,并研究其抗氧化功能。【方法】荧光定量PCR检测氧化应激下Abferritin基因的表达量,并将其基因克隆到表达载体p ET28a以构建重组质粒p ET28a-Abferritin,转化大肠杆菌BL21(DE3)得到重组菌BL/p ET28aAbferritin,IPTG诱导目的蛋白表达并利用镍柱亲和层析纯化该蛋白。比色法测定Abferritin蛋白的Fe2+氧化酶活性,自由基清除实验测定其抗氧化功能。菌落计数法观察重组大肠杆菌在H2O2应激条件下的存活率。【结果】Abferritin基因在氧化应激下表达增高。重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,通过Ni2+亲和层析纯化获得了Abferritin蛋白。该蛋白具有Fe2+氧化酶活性,能有效减少氧自由基的形成及提高大肠杆菌抵抗氧化应激的能力。【结论】氧化应激能诱导Abferritin基因表达上调,且该蛋白具有亚铁氧化酶活性和抗氧化功能。