转基因白桦中GUS 基因表达的定量分析

以转基因白桦(Betula platyphylla)为材料, 采用单酶切结合Southern杂交的方法揭示不同转基因植株中GUS基因的整合拷贝数为1-4个。采用组织化学染色法定性分析不同整合方式转基因白桦植株中GUS基因的表达。结果表明, 11个转基因植株中有2株出现了GUS基因沉默, 其余植株均有不同水平的GUS表达。在此基础上应用分光光度法定量分析不同拷贝数的GUS转基因白桦中b-葡萄糖醛酸酶活性。结果表明, 在11个转基因无性系中除2个株系的GUS基因沉默外, 其它9个转基因植株中GUS酶活力差异明显, 但这种差异与GUS基因的拷贝数没有必然联系。     

农杆菌介导的苜蓿次级体细胞胚的遗传转化

采用农杆菌菌株GV3101感染子叶期苜蓿体细胞胚来研究苜蓿次级体细胞胚的遗传转化方法。农杆菌菌株GV3101双相载体pCAMBIA2301,此双相载体具有gus报告基因和nptⅡ抗卡那霉素筛选基因。感染的子叶期苜蓿体细胞在75 mg/L卡那霉素筛选压下,经过一系列诱导培养,最终获得转基因植株。然后,通过GUS组织化学定位分析来检测转基因植株不同器官中的GUS表达,并进一步通过PCR和Southern杂交确定转基因的稳定整合和转化率。结果表明转基因植株不同器官均有GUS表达,整合的nptⅡ基因的拷贝数是1~4,获得的转基因植株的转化率是65.82%。     

用无启动子的GUS报告基因捕获水稻基因启动子

构建了嵌合质粒p13DGUTs,它是在Ds转座子中插入了无启动子的B．葡萄糖醛酸酶报告基因(GUS),用于分离水稻基因启动子。将p13DGUTs转化粳稻品种中花11的胚性愈伤组织,获得了496个转基因植株。抗性愈伤组织与转基因植株的GUS染色与PCR分析表明整合在水稻染色体上的Ds因子都发生了随机跳跃。转基因植株T0代与部分T1代的GUS染色结果表明,M92转基因植株中Ds转座子整合位置上游的水稻基因启动子指导GUS基因的表达及表达的特性是可遗传的。文章对此方法在分离水稻基因启动子与基因上的应用进行了讨论。     

玉米Ubi-1启动子在可育转基因玉米植株中的表达活性

本工作将玉米泛素基因-1启动子(Ubi-1)与大肠杆菌β-葡糖苷酸酶基因(gus,uidA)的编码区融合,通过基因枪粒子轰击方法转化来自玉米未成熟胚盾片组织的I-型愈伤组织,经PPT选择获得可育的玉米转基因植株,并采用组织化学方法分析了Ubi-1启动子驱动的gus基因在不同组织、细胞中的表达活性,发现gus基因在除花药壁以外的其它所试组织中均可以有效表达.UbiGUS在花粉、卵细胞和T1代转基因植株未成熟胚中的表达显示该启动子在植株发育的早期阶段即具有活性.对T0代转基因植株的花粉进行GUS组织化学染色,gus基因呈11分离,显示外源基因在转基因植株中以孟德尔方式遗传.同时发现,使用玉米本身的启动子Ubi-1可以降低外源基因在转基因玉米中的拷贝数,进而避免基因沉默现象的发生.目前已得到第二代转基因种子.     

GUS基因拷贝数对转基因在受体植物烟草中表达的影响

对农杆菌介导法获得的转 β_葡糖醛酸酶 (β_glucuronidase ,GUS)基因 (uidA)烟草 (NicotianatabacumL .)进行GUS表达分析 ,发现部分转基因植株无GUS活性。进一步Southern杂交结果发现 ,GUS基因失活植株的基因组中整合了多个uidA拷贝 ,而GUS活性高的转基因植株多为uidA单拷贝整合 ,表明uidA基因失活与基因多拷贝整合有关。Northern杂交结果显示 ,失活植株无特异uidARNA杂交带 ,而GUS活性高的植株可检测到明显的杂交信号 ,说明多拷贝引起的基因失活发生在RNA水平。     

玉米Ubi－1启动子在可育转基因玉米植株中的表达活性

本工作将玉米泛素基因－1启动子（Ubi-1)与大肠杆菌β－葡萄糖苷酸酶基因（gus,uidA)的编码区融合,通过基因枪粒子轰击方法转化来自水成熟胚盾片组织的I－型愈伤组织,经PPT选择获得可育的玉米转基因植株,并采用组织化学方法分析了Ubi-1启动子驱动的gus基因在不同组织,细胞中的表达活性,发现gus基因在除花药壁以外的其它所试组织中均可以有效表达。Ubi：GUS在花粉,卵细胞中T1代转基因植株未成熟胚中的表达显示该启动子在植株发育的早期阶段即具有活性。对T0代转基因植株的花粉进行GUS组织化学染色,gus基因呈1：1分离,显示外源基因在转基因植株中以孟德尔方式遗传。同时发现,使用玉米本身的启动子Ubi-1可以降低外源基因在转基因玉米中的拷贝数,进而避免基因沉默现象的发生。目前已得到第二代转基因种子。     

基因枪法和农杆菌介导法对水稻转基因拷贝数的基因重排概率的影响

基因枪法和农杆菌介导法转化的外源DNA整合到植物梁色上是随机进行的,因此,它们可能会产生不同的转基因拷贝数,得到不同的基因表达盒完整率,这反过来会影响基因的表达,为证实这一假说,作首先将同一质粒pAcPG-CAM分别用基因枪法和农杆菌介导法转化到水稻（Oryza sativa L.cv.TNG67)愈伤组织,为了揭示不同质粒是否也出现类似结果,也用农杆菌介导法,基因枪法分别将pTOK233和pJPM44导入水稻愈伤组织,并获得一批转基因植株,Ｒ０代值转基因表达的分析用ＧＵＳ组织化学染色法,用质粒上的单切点酶酶切基因组DNA后的Southern杂交结果确定转基因拷贝数,总DNA髟双切点酶（分别位于表达盒两侧）酶切后的Southern杂交结果确定了完整转基因表达盒数目,结果表明,农杆菌介导转化法的转基因植株的转基因拷贝数相对少一些（平均为2．1和2．3）,而基因枪法转化产生的转基因植株的转基因撬贝数相对多一些（平均为4．2和5．6）,并且农杆菌介导转化法的转基因植株的基因表达盒DNA重排概率低于由基因枪法转化产生的转基因植株的基因表达盒DNA重排概率－农杆菌介导转化法的DNA重排概率为0．07和0．106,由基因枪法转化的DNA重排概率为0．57和0．66。研究还分析了基因表达情况与转基因的拷贝数或完整表达盒数之间的关系,GUS定量分析结果表明,为了准确揭示转基因的表达情况与转基因之间的关系,用完整基因表达盒数而不是转基因DNA拷贝数更准确,并于用不同转基因方法将同种质粒导入植物体分析基因表达盒DNA重排概率为首次报道。     

基因枪转化获得的转基因水稻中外源基因整合与表达规律研究

通过基因枪法将cecropin B和bar基因共转化水稻,获得多个水稻优良品系的转化材料,对转基因的结构和表达的系统分析,发现外源基因的整合模式多种多样,有简单也有复杂,其中插入位点数的变化范围为1－7个,拷贝数的变化范围为1－10个,转基因拷贝数的多少与其表达和沉默不存在必然的联系,相同整合模式的转基因事件中基因的表达存在较大的差异,选择标记基因bar比非选择标记基因cecropin B的表达框的完整性和转录概率要高,但是发现大部分表达框完整的bar基因发生基因沉默,而在终止子发生序列丢失的cecropin B基因的表达则明显提高。     

水稻谷蛋白GluA-2基因5′上游序列控制下的UidA基因在转基因水稻胚乳中的表达模式

为了研究谷蛋白胚乳特异性表达启动子在我国栽培稻品种中的表达模式,将UidA基因分别置于水稻谷蛋白GluA—2基因750bp和2．3kb上游序列下游,利用农杆菌转化法导人栽培稻品种中花8号并获得转基因植株。Southern blot检测表明,UidA基因已经整合到水稻基因组当中并以单拷贝存在。Northern blot检测表明,开花后13～15d和11～13d,UidA基因和水稻内源的GluA—2基因的表达量分别达到最高,随后逐渐降低。对转基因植株种子的GUS染色表明,UidA基因仅在胚乳中表达,在糊粉层中GUS表达量最高。测定了2．3kb和750bp转基因植株种子的GUS活性,结果表明前者的GUS活性是后者的2～3倍。序列分析表明,位于GluA—2基因转录启始位点上游2170bD的G-box可能是一个与表达量相关的顺式调控元件。     

水稻sbe1启动子驱动的反义sbe-GUS融合基因在转基因水稻中的表达

为研究水稻基因启动子对外源基因在转基因水稻中表达的影响,构建了由sbe1启动子引导的反义sbe-GUS融合基因。经农杆菌介导,将不同的融合基因导入水稻中,定量测定转基因水稻植株不同组织中的GUS酶活力。结果表明,sbe1启动子可驱动反义sbe-GUS融合基因在转基因水稻植株的胚乳中高效表达,而在颖壳、胚和茎叶等组织中的表达活性较弱。证实sbe1启动子在驱动外源基因的表达上表现有明显的组织特异性。     

超声波介导铁蛋白基因转化苹果的研究

以嘎拉苹果的叶片为转化受体,应用超声波法将菜豆铁蛋白基因导入受体中.实验表明,以0.5 W/cm2的声强、25℃、20 min超声波处理的转化效果最佳,抗性愈伤组织的比例高达24%.抗性愈伤组织经诱导获得了16个苹果抗性植株,有11株表现出GUS阳性,阳性比率为2.75%.经PCR检测,11株GUS阳性植株中有6株能扩增出目的条带;而Southern blotting实验表明,菜豆铁蛋白基因仅在2个苹果转基因株系的基因组中实现了完整插入,并且杂交的信号较强;进一步RT-PCR检测实验显示,外源菜豆铁蛋白基因在上述2株转基因植株中并未转录,发生了基因沉默.     

利用根癌农杆菌法获得转基因水稻植株及其后代

在100μmol／L乙酰丁香酮（AS）等vir基因诱导分子存在的情况下,用含双元载体pBYT2的根癌农杆菌菌株EHA101同水稻（OrizasativaL．）台北309悬浮培养细胞共培养3天。经过2个月的连续筛选,共从364颗同根癌农杆菌共培养的悬浮培养细胞团中得到17个具有稳定潮霉素抗性和GUS表达的愈伤组织。对从8个转化组织中得到的10株可能的R0代转基因植株及其后代进行外源基因的整合和表达分析,Southern分析表明外源基因已稳定地整合进水稻基因组中并实现了有性遗传传递。杂交结果显示在其中一个转化系的植株中有5个拷贝的T－DNA整合,而其余的转化系则只整合了1个拷贝。转基因水稻细胞及植株中GUS活性的组织化学染色观察和荧光分析表明玉米ubiquitin基因启动子在水稻细胞中能高效启动gus报告基因的表达。ndPAGE－X－Gluc法检测表明转基因水稻细胞中表达的GUS蛋白比Sigma公司的标准GUS蛋白（SigmaCo．G0786）要小,而与来自大肠杆菌HB101（pBI1121）中的GUS蛋白大小相同。结果表明,根癌农杆菌可有效且可靠地介导外源基因转化水稻。     

转基因白桦的花粉活力及外源基因的遗传表达分析

采用荧光素二乙酸酯（FDA）染色比较分析转基因白桦花粉的活力的结果表明,转基因白桦的花粉活力均低于非转基因白桦。应用多重PCR和Northern杂交技术分析表明,转基因白桦花粉中有外源基因整合和转录表达。检测转基因白桦花粉中gus报告基因的活性,显示gus报告基因在花粉表达。     

农杆菌介导玉米胚性愈伤的遗传转化研究

利用3种不同类型的农杆菌菌株C58、LBA4404和EHA105携带外源GUS基因分别侵染玉米自交系齐319和18(红)胚性愈伤.结果显示,不同的菌株和自交系间的搭配,其遗传转化效率差异很大,GUS瞬时表达率呈极显著差异(F=24.92**),抗性愈伤率也呈极显著差异(F=19.43**).其中,EHAl05-齐319组合遗传转化效率最高,其GUS瞬时表达率平均为55.5%,最高可迭71.1%;其抗性愈伤率平均为14.4%,最高可达20%;对22株转基因To代抗性植株进行PCR检测,其中PCR呈阳性植株有11株,阳性率为50%.进一步对此22株To代抗性植株进行叶片组织化学染色分析,结果显示,PCR呈阳性的植株中均有GUS基因表达.从而证明,外源GUS基因在转基因玉米To代植株中得到稳定表达,而且验证了PCR检测结果和GUS表达分析结果的一致性.     

抗除草剂转基因大豆后代遗传分析

分析了来源于农杆菌介导的4个独立的大豆转化系的后代遗传特性。分别采用种子切片GUS染色方法和除草剂涂抹以及喷洒方法检测gus报告基因和抗除草剂bar基因在后代的表达。其中3个转化系T1代gus基因和bar基因能够以孟德尔方式3：1连锁遗传,说明这2个基因整合在大豆基因组的同一位点。这3个转化系在T2代获得了纯合的转化系,并能够稳定遗传至T5代。有一个转化系在T1代GUS和抗除草剂检测都为阴性,但通过Southern杂交证明转基因存在于后代基因组,显示发生了转基因沉默。为了证明转基因沉默是转录水平还是转录后水平,T1代植物叶片接种大豆花叶病毒（SMV）并不能抑制转基因沉默,说明该转化系基因沉默可能不是发生在转录后水平。     

番茄rbcS3A启动子控制的GUS融合基因在转基因水稻中的表达

为研究不同启动子用于转基因水稻,克隆了番茄Rubisco小亚基rbcS3A基因的5′上游调控区,构建了由rbcS3A启动子引导的GUS嵌合基因,并经农杆菌介导导入到水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性的定性与定量测定结果表明,rbcS3A启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株茎和叶组织中高效表达,而在根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出一定的组织特异性。在转基因水稻中,番茄rbcS3A启动子驱动外源基因的表达不受光诱导。     

卤代烷烃脱卤酶基因在拟南芥中反式失活系统的建立

以细菌Xanthobacter autotrophicus卤代烷烃脱卤酶基因为遗传负选择标记,建立了该基因在拟南芥中反式失活的实验系统,在卤代[烷烃脱卤酶转基因的拟南芥中,有1株表现为转基因失活,离体核run-off转录实验表明为基因转录后沉默（这里特指沉默位点）,用这一转基因沉墨植株与同源转基因高效表达植株（这里特指同源转基因位点）杂交,结果96％的F1代植表现为同源基因反式失活,将F1代植株自交,使部分沉默位点与反式失活的同源转基因位点分离,结果200株子代中有42株表现DhlA活性,158株无DhlA活性,即 dhlA沉默植株与表达植株之比为3．76：1,表明沉默位点是以孟德尔显性因子方式使同源转基因位点反式失活的。     

水稻细胞质1，6—二磷酸果糖酶基因1195bp的上游调控序列的克隆及其在转基因水稻中的表达研究

1,6－二磷酸果糖酶（EC3．13．11）催化1,6－二磷酸果糖分解为6－磷酸葡萄糖和无机磷酸。在高等植物的光合作用细胞中,存在两种1,6－二磷酸果糖酶：即叶绿体型1,6－二磷酸果糖酶和细胞质型1,6－二磷酸果糖酶。由于细胞质型1,6－二磷酸果糖酶在植物碳水化合物代谢中起重要作用,且具有表达特异性,本试验通过Genome Walking分离了水解细胞质型1,6－二磷酸果糖酶基因的上游序列,并将其与β－葡糖醛酸酶（GUS）报告基因建成嵌合表达载体。采用基因枪法转化水稻,在转基因水稻中分析了GUS的表达活性和特异性。组织化学检测表明,在转基因水稻的成熟叶片中,GUS基因只在叶肉细胞中表达,在表皮细胞,泡状细胞,维管组织中均无表达,在叶鞘中的表达与叶片中相似,仅仅在叶肉细胞中表达,在根,茎所有细胞中均没有蓝色反应,为进一步研究1,6－二磷酸果糖酶基因启动子在水稻中的表达量,对12株独立来源的转基因水稻的GUS活性进行了荧光定量分析。结果显示,水稻成熟叶片中的GUS活性平均值为7031．5pmol4-MU^-1.min^-1.mg蛋白。在不同器官及组织中表达活性有差异,在转基因水稻的叶片,叶鞘中GUS均有较强的表达,在根、茎中未检测到GUS活性,实验结果表明,ATG上游1195bp调控区足以导致GUS基因在水稻中的特异性表达,因此该片段包含有使报告基因在叶肉细胞中特异性表达的所有顺式调控元件。     

高羊茅和黑麦草农杆菌介导转化体系的研究

利用C58C1农杆菌菌系（携带的表达载体上含GUS基因和nptII基因）感染4个草坪草品种追寻者、爱神特、腾跃和守门员成熟胚来源的愈伤组织,共培养后部分愈伤组织进行X-Gluc组织化学染色检测,其余愈伤组织在含G418 10-25 mg/L的MS改良培养上先后筛选抗性愈伤组织和分化抗性再生植株,对移栽成活的144棵抗性再生植株分别进行了ELISA检测、PCR检测和组织化学染色检测。愈伤组织阶段X-Gluc染色检测结果表明,4个草坪草品种GUS基因瞬间表达率8.6%～46.9%,爱神特愈伤组织对农杆菌侵染最为敏感,其次是腾跃和守门员,追寻者最不敏感;ELISA检测结果表明,45株呈现阳性,证明nptII基因已转入草坪草并已表达;PCR检测结果与ELISA检测结果一致,表明nptII基因确实已经整合到了草坪草基因组中,且没有发生沉默现象;转基因植株X-Gluc染色检测结果表明,GUS基因在43株中得到了稳定表达,在2株中发生了沉默现象。4个草坪草品种抗性再生植株分化率0～43.5%,转化率0～21.5 %。结果还表明,GUS基因瞬间表达率与稳定转化率在草坪草上很不一致,不能作为衡量基因型转化效果的指标。     

玉米脱氧麦根酸分泌通道蛋白基因YS3启动子的克隆与启动活性分析

缺铁是世界范围内农业生产面临的严重问题,玉米通过分泌脱氧麦根酸(2’-deoxymugineic acid, DMA)吸收利用土壤中的难溶性铁。为探明玉米DMA分泌通道蛋白基因YS3的表达和调控机制,本文通过克隆获得长为2813 bp的YS3基因启动子,该序列含有大量TATA-box、CAAT-box等启动子基本元件,以及光响应、激素调控等多个顺式调控元件;构建YS3启动子驱动GUS基因的植物表达重组载体pCAMBIA-YS3GUS,利用农杆菌介导转化拟南芥,获得pYS3::GUS转基因植株,对转基因植株进行GUS组织化学染色,并通过石蜡切片技术对转基因植株进行组织观察,分析pYS3::GUS转基因植株中YS3基因启动子的活性。结果表明,YS3启动子主要驱动GUS基因在拟南芥根部表达,且主要集中在根部表皮细胞,机械损伤可激发YS3启动子活性,驱动GUS基因在损伤临近部位表达。本研究对于理解玉米DMA分泌的分子调控机理方法od3 gmaigensuan有重要意义。