鸡传染性法氏囊病病毒研究进展

传染性法氏囊病(Infection bursal disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病,给世界各国的禽养殖业带来了巨大损失。自IBDV发现至今新的变异株不断出现,分子结构的改变导致病毒致病力的改变及宿主对疫苗应答的改变,使得传统的疫苗已不能控制其流行,因此各国学者对其基因组结构和功能进行了广泛深入的研究,并积极研制新型有效的疫苗以达到防治的目的。 1 基因组结构和功能 IBDV基因组由A(3.2kb)、B(2.8kb)两个双链RNA节段构成。A编码形成VP2蛋白(37-40k…     

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株GX8/99株的致病性

鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)超强毒株GX8/99,系1999年从广西一自然发病鸡群采集到.用原始病鸡法氏囊悬液连续3次人工感染SPF鸡后,再取其法氏囊制备悬液,分装,在-70℃保存.以此悬液经卵黄囊接种10日龄SPF鸡胚,测定鸡胚的半数致死量(ELD50).随着鸡的日龄和接种剂量的不同,其致死率有很大差异.对28～30日龄SPF鸡,病毒接种量为200个ELD50时,感染后7日内死亡率最高可达73%～90.5%(11/15和19/21);感染量为20个ELD50时,死亡率亦可达53%～92%(8/15和23/25).以500个ELD50感染28～104日龄的SPF鸡,死亡率均在55.1%～67.2%;甚至113～120日龄的SPF鸡,感染后仍有10%～15%致死率.但128日龄的SPF鸡感染后既不引起死亡也不表现任何症状,但抗体全部转阳.人工接种发病死亡的鸡,其法氏囊的出血程度也随感染量和年龄而异.50日龄鸡接种2000个ELD50后,死亡的鸡100%(12/12)法氏囊严重出血;而40日龄鸡感染200个ELD50后,死亡鸡中仅17%(3/18)发生出血.在2、3、4周龄带有母源抗体的商品代蛋鸡,以2000个ELD50病毒接种后,只引起10%(2/20)、35%(7/20)和35%(7/20)的死亡率.但在5周龄商品代蛋鸡,仅接触感染的致死率可达61.3%(98/160).另一批商品代蛋鸡,在4周龄和5周龄人工接种200个ELD50病毒后,死亡率分别是81.6%～94.3%(62/76～33/35)和93.9%～94%(31/33～47/50).通过总共1200多羽鸡的试验表明,GX-8/99株是一个超强毒IBDV毒株,表现为高死亡率(最高可达94%),易感年龄延长至4月龄,中枢性免疫器官法氏囊出血严重和胸腺明显萎缩.     

鸡传染性法氏囊病上海超强毒株NH99的分离与鉴定

通过对上海近郊某鸡场数群10日龄左右的病鸡的临床症状、病理变化、病毒分离、纯化、动物回归、血清学检测及病毒核酸纯化、VP2基因序列的测定与分析,确认上海地区以发病日龄早,发病率、死亡率高为特征的鸡传染病为超强毒型鸡传染性法氏囊病,病原具有鸡传染性法氏囊病病毒超强毒 (vvIBDV)的分子特征,为vvIBDV.     

鸡传染性法氏囊病上海超强毒株NH99的分离与鉴定

通过对上海近郊某鸡场数群 10日龄左右的病鸡的临床症状、病理变化、病毒分离、纯化、动物回归、血清学检测及病毒核酸纯化、VP2基因序列的测定与分析 ,确认上海地区以发病日龄早 ,发病率、死亡率高为特征的鸡传染病为超强毒型鸡传染性法氏囊病 ,病原具有鸡传染性法氏囊病病毒超强毒 (vvIBDV)的分子特征 ,为vvIBDV。     

鸡传染性法氏囊病病毒Gt株VP5基因缺失株感染性克隆的构建

传染性法氏囊病病毒 (IBDV)是双链,双节段RNA病毒,其基因组由A、B两个节段组成,编码结构蛋白VP1-VP4和非结构蛋白VP5。【目的】利用反向遗传操作构建拯救VP5基因缺失重组IBDV。【方法】利用体外定点突变技术,缺失IBDV Gt株VP5基因,通过多重PCR在基因组两端分别引入锤头状核酶序列(HamRz)和丁肝病毒核酶序列(HdvRz)。将带有核酶序列的IBDV基因组插入载体pCAGG的b肌动蛋白启动子下游,构建了IBDV感染性克隆pCAGGmGtA △VP5HRT,将该感染性克隆与pCAGGmGtBHRT共转染DFⅠ细胞。【结果】RT-PCR和间接免疫荧光均显示获得重组病毒,将其命名为rmGtA △VP5。IBDV VP5基因缺失感染性克隆的成功构建为从分子水平上深入研究vp5基因功能奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒中国强毒株A节段cDNA基因的克隆和序列分析

以来自哈尔滨传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ） 强毒株（Ｈａｒｂｉｎ 毒株,Ｈ） 的基因组ＲＮＡ为模板,用反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ ＰＣＲ） 的方法得到了其Ａ 节段的全长ｃＤＮＡ 片段,分５＇端（１ ６５９ｂｐ） 和３＇端（１ ４４４ｂｐ） 上下两段分别克隆到ｐＧＥＭＢ○Ｒ － Ｔ 载体上,测定了其核苷酸顺序,在长为３ １０１ ｂｐ 中含有两个阅读框ＯＲＦＡ１ 和ＯＲＦＡ２ ,分别编码１ ０１２ 个氨基酸的前体蛋白（ＶＰ２ － ４ －３） 和１４５ 个氨基酸的ＶＰ５,ＯＲＦＡ１ 和ＯＲＦＡ２ 有部分的重叠。将核苷酸序列及推测出的氨基酸序列与已报道的ＩＢＤＶ 血清Ⅰ型和Ⅱ型毒株的相应序列进行了比较,结果表明：Ｈ 毒株与其它血清Ⅰ型毒株之间,在核苷酸水平上存在２５ｂｐ － ２６７ｂｐ 的差异;在氨基酸水平上存在１７ ～４０ 个氨基酸的差异。在ＶＰ２ － ４ － ３ 内比较显示,Ｈ 毒株与Ｐ２ 、Ｃｕ－ １ 之间氨基酸的差异最小为１ ．７％ ,Ｈ 毒株与ＵＫ６６１ 之间氨基酸的差异最大为３ ．９ ％ 。变异主要发生在ＶＰ２ 的可变区（２０６ － ３５０ 位氨基酸） ,在Ｈ 毒株所特有的１２ 个氨基酸当中,该区就占５ 个,代表１ ．７６ ％ 的变异。ＶＰ４、ＶＰ３ 和ＶＰ５区各有     

传染性法氏囊病病毒不同分离株vp2基因部分核酸序列分析

根据已报告的传染性法氏囊病病毒（Infectious bursd disease virus,IBDV)cDNA序列,设计引物,用RTPCR扩增CH（鸡）,DU（鸭）,GE（鹅）和SP（麻雀）四种不同源IBDV分离株的vp2基因高变区。核酸序列测定分析表明,四种不同源IBDV分离株vp2基因高变区的同源性为97％,推导编码蛋白氨基酸序列的同源性98％,两个亲水区和七肽区的氨基酸序列完全一致。本研究结果提示,自然感染IBDV的鸭,鹅和麻雀不仅可成为病毒携带者或传染源,而且在病毒变异中起一定作用。     

鸡传染性法氏囊病病毒内蒙古毒株VP2基因的克隆和序列分析

以鸡传染性法氏囊病病毒内蒙古毒株（ＩＢＤＶ-ＮＭ）ｄｓＲＮＡ为模板,用ＲＴ-ＰＣＲ法扩增其主要寄主保护抗原ＶＰ２基因的全长ｃＤＮＡ,克隆于ｐＵＣ１９的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点,进行了全序列分析。序列比较发现ＩＢＤＶ-ＮＭ毒株ＶＰ２基因与已报道的其它７个ＩＢＤＶＣＪ８０１ｂｋｆ、Ｃｕ１、ＰＢＧ９８、５２／７０、００２—７３、ＳＴＣ及ＶａｒｉａｎｔＥ毒株之间高度同源,其核苷酸序列的同源率为９１.６％～９６．２％,推测的氨基酸序列的同源率为９６.２％～９８．６％。ＩＢＤＶ-ＮＭ毒株ＶＰ２高变异区的第一个亲水区氨基酸序列与ＣＪ８０１ｂｋｆ、Ｃｕ１、ＰＢＧ９８、５２／７０、ＳＴＣ、００２—７３比较,有一个氨基酸差异,第二个亲水区氨基酸序列与上述６个毒株完全相同。而与ＶａｒｉａｎｔＥ比较,两个亲水区内各有两个氨基酸差异。此外,ＩＢＤＶ-ＮＭ毒株ＶＰ２具有强毒株所特有的７肽保守区：ＳＷＳＡＳＧＳ。这些结果表明,ＩＢＤＶ-ＮＭ毒株为标准血清Ⅰ型ＩＢＤＶ强毒株。     

传染性法氏囊病超强毒山东分离株SD0210的致弱研究

本研究将鸡传染性法氏囊病超强毒(vvIBDV)SD0210株经SPF鸡胚培育及鸡胚成纤维细胞(CEF)传代培养,获得了对CEF适应的细胞毒,并对细胞毒进行了致病性、回归动物的稳定性试验及免疫原性方面的试验,结果表明已成功获得了具有髙免疫原性且安全无毒力返强的致弱株,并初步揭示了vvIBDV在适应细胞、从超强毒力向弱毒力转化过程中,VP2高变区氨基酸序列的变化情况。SD0210株培养至18代开始适应细胞,出现细胞病变。21代细胞毒已对SPF鸡失去了致病性,在鸡体内连续传代15代毒力不返强,而且具有较高的免疫原性。     

超强毒IBDV细胞克隆化毒回归鸡后的致病性与VP2基因高变区的分子变化

为了研究超强毒鸡传染性法氏囊病病毒(vvIBDV)的致病性及其VP2基因高变区的分子变化,以vvIBDV GX8/99株囊毒为研究对象,将该毒在SPF鸡胚连传10代后,再在鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续盲传.该病毒在CEF上传至22代时开始引发CEF细胞病变,随之在96孔细胞培养板上用无限稀释法连续克隆2次后获得了4个病毒克隆,再将该4个病毒克隆分别连续回传3～5周龄SPF鸡10代.分别比较4个克隆毒及其回传SPF鸡后不同传代毒,对4～6周龄SPF鸡的致病性及VP2高变区氨基酸分子的变化,结果表明,4个克隆化毒的细胞培养毒对SPF鸡只有0～6.7%的致死率,不同克隆毒的SPF鸡传代毒对SPF鸡的致病性却都逐渐增强,但程度差异很大,其中克隆#5在回鸡1、5和10代后的致死率从0分别增加到10%、20%和27%;克隆#4从6.7%增加至13%、17%和23%;但克隆#1和#3的致病性变化相对较小.相对于原始囊毒及鸡胚毒,4个克隆化毒在测序的VP2高变区的约145个氨基酸中,有10个位点发生了相同的变异,变得与适应细胞的疫苗毒D78株基本一致,在回鸡传代导致对鸡毒力增强的过程中,这10个位点中大多数氨基酸不再变化,只有第253位和256位氨基酸从囊毒的Q和I变为细胞适应毒的H和V后,有些病毒克隆回鸡至第10代时又变为原囊毒的Q和I,这表明VP2高变区大多数氨基酸的变异可能与病毒的致病性关系不密切,而与对细胞培养或组织的亲和性的关系更为密切.本研究最重要的意义在于建立的超强毒GX8/99株细胞克隆化毒及其相应的回鸡传代毒系列,为研究vvIBDV其它基因变异与致病性及其它生物学特性的关系,提供了一个新的思路和必要的研究材料.     

IBDV多聚蛋白基因真核表达质粒的构建与表达

将IBDV上海超强毒株的多聚蛋白基因(vp2-4-3)克隆入真核表达载体pALTER-MAX,构建成功pALTER-MAX-VP2-4-3真核表达质粒,经纯化后,pALTER-MAX-VP2-4-3在Lipofectamie^TM2000介导下转染Vero细胞、11日龄鸡胚的绒毛尿囊膜(CAM)和肌肉注射2日龄的雏鸡,1周后,分别提取细胞或组织中的总DNA或总RNA,用DIG标记探针均可检测到阳性杂交信号;转染的Vero细胞飞片和肌肉冰冻切片,进行免疫荧光检测均呈现阳性结果;转染的鸡胚CAM匀浆上清,用兔抗IBDV超强毒的高免血清,经Dot—ELISA检测呈现阳性。表明转染后基因获得表达,表达的蛋白具有免疫反应性。     

IBDV多聚蛋白基因真核表达质粒的构建与表达

将IBDV上海超强毒株的多聚蛋白基因(vp2-4-3)克隆入真核表达载体pALTER-MAX,构建成功pALTER-MAX-VP2-4-3真核表达质粒,经纯化后,pALTER-MAX-VP2-4-3在LipofectamieTM 2000介导下转染Vero细胞、11日龄鸡胚的绒毛尿囊膜(CAM)和肌肉注射2日龄的雏鸡,1周后,分别提取细胞或组织中的总DNA或总RNA,用DIG标记探针均可检测到阳性杂交信号;转染的Vero细胞飞片和肌肉冰冻切片,进行免疫荧光检测均呈现阳性结果;转染的鸡胚CAM匀浆上清,用兔抗IBDV超强毒的高免血清,经Dot-ELISA检测呈现阳性.表明转染后基因获得表达,表达的蛋白具有免疫反应性.     

传染性法氏囊病超强毒山东分离株SD0210的致弱研究

本研究将鸡传染性法氏囊病超强毒(vvIBDV)SD0210株经SPF鸡胚培育及鸡胚成纤维细胞(CEF)传代培养,获得了对CEF适应的细胞毒,并对细胞毒进行了致病性、回归动物的稳定性试验及免疫原性方面的试验,结果表明已成功获得了具有高免疫原性且安全无毒力返强的致弱株,并初步揭示了vvIBDV在适应细胞、从超强毒力向弱毒力转化过程中,VP2高变区氨基酸序列的变化情况.SD0210株培养至18代开始适应细胞,出现细胞病变.21代细胞毒已对SPF鸡失去了致病性,在鸡体内连续传代15代毒力不返强,而且具有较高的免疫原性.     

一步法扩增克隆IBDV上海超强毒VP2—4—3基因

分离、纯化了鸡传染性法氏囊病病毒超强毒 (vvIBDV)上海株SH95的病毒核酸dsRNA ,应用随机引物将RNA反转录成cDNA ,以此为模板一步扩增出A片段前体融合蛋白基因即VP2 4 3基因 ,将其克隆入 pGEM T载体 ,并进行序列分析 ,其与超强毒株HK4 6的核苷酸序列的同源性达 98% ,整个基因有 5个氨基酸差异 ,同源性达99.5 1% (10 0 7/ 10 12 )。