特异阻断乙酰胆碱受体的海南产α*-芋螺毒素的研究

国际上被誉为"海洋药物宝库"的芋螺毒素(CTx),具有特异结合动物体内各种离子通道和受体的特殊功能。其中的α*-芋螺毒素(α*-CTxs)能特异性地作用于乙酰胆碱受体(n ACh Rs),对其亚型具有极高的选择性阻断活性。不同的亚基组合形成的各种乙酰胆碱受体亚型,在正常健康状态下和多种疾病状态下起着很重要的生理和病理学功能,这些功能至今尚不很清楚,因而发现和开发各种亚型的选择性分子探针,如α*-CTxs将有助于阐释各个亚型的精细结构和功能。深入研究特异阻断乙酰胆碱受体不同亚型的α*-CTxs的结构与功能,及其与受体相互作用的机理具有很重要的科学意义,将有助于研发出与n ACh Rs相关的多种疑难杂症的治疗药物,包括神经痛、癌症化疗、成瘾、痴呆、重症肌无力、精神分裂症、癫痫、乳腺癌、肺癌、脑脊髓炎,以及其他神经疾病等。近年来,我们实验室经过大量筛选研究,鉴定出5个海南产新颖α*-芋螺毒素,对它们的人工合成、三维结构、作用靶点、与受体相互作用机制、药理药效等进行了深入的研究。现对上述特异阻断乙酰胆碱受体不同亚型的5个海南产α*-芋螺毒素的研究进展和应用前景进行综述。     

α-芋螺毒素与乙酰胆碱结合蛋白共结晶的结构特点

烟碱型乙酰胆碱受体(n AChRs)是配体门控离子通道,它与疼痛、阿尔茨海默氏病、成瘾等疾病密切相关。α-芋螺毒素是n AChRs的拮抗剂,也是治疗上述疾病的先导药物。乙酰胆碱结合蛋白(ACh BPs)与n AChRs的配体结合结构域同源性较高,它们的药理特性和离子通道激活机制也相类似,α-芋螺毒素与ACh BPs共结晶结构解析了α-芋螺毒素残基如何选择结合n AChRs。现对α-芋螺毒素与ACh BPs共结晶结构进行综述,旨在剖析α-芋螺毒素与n AChRs相互作用的关键残基,为开发药效更好的芋螺毒素提供参考依据。     

α-芋螺毒素的研究现状

α-芋螺毒素是近年来研究较多的一种海洋生物神经毒素,它特异性竞争结合烟碱型乙酰胆碱受体,化学结构独特。本文介绍了有关α-芋螺毒素的种类、结构特征、生物学活性和制备方法等方面的研究进展,及其在生物化学、生物学以及新药开发等方面的应用前景。     

作用于烟碱乙酰胆碱受体的α~*-芋螺毒素研究进展

芋螺毒素(conotoxin,conopeptide,CTx)是由热带海洋中的肉食性软体动物芋螺分泌产生的一大类生物活性肽,它们相对分子质量小,能特异地作用于动物体内各种离子通道和受体,具有巨大的药物开发价值。其中,A-超家族的α-芋螺毒素(α-CTx)是发现最早的且最重要的一类成员,它能特异性作用于烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs),是肌肉或神经型nAChRs的选择性阻断剂。nAChRs与中枢神经系统紊乱如疼痛、成瘾、癌症等多种疾病密切相关。近年来,人们陆续发现其他超家族的芋螺毒素中也有成员可阻断nAChRs,如αA-、αB-、αO-、αC-、αD-、αS-等家族的芋螺毒素。上述能阻断nAChRs的芋螺毒素统称为α~*-芋螺毒素(α~*-CTx)。α~*-芋螺毒素对nAChRs阻断活性的差别与它们的结构有着密切的联系。结合国内外研究现状,对α~*-CTx与nAChRs相互作用的关键位点以及结构与功能的关系进行综述,可为相关研究提供参考。     

拉特罗毒素的结构、受体及促分泌机制

α-拉特罗毒素(α-latrotoxin,α-LTX;也称:α-黑寡妇蜘蛛毒素)是一种从黑寡妇蜘蛛毒液中纯化到的,可以有效地触发神经元轴突终末神经递质的释放和分泌细胞分泌的神经毒素。它在细胞膜上存在三类受体。通过与其受体的结合,α-LTX可以通过对细胞膜的穿孔作用以及受体介导的跨膜信号转导两种方式触发细胞分泌。对α-LTX的促分泌作用机制的研究可以促进人们对分泌及其调节机制的深入认识。     

重组α-银环蛇毒素的纯化及活性分析

以表达重组α-银环蛇毒素的高效表达菌株BL21(PDZ04)为材料,研究重组α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)的分离纯化。采取亲和色谱和离子交换色谱的方法都得到了重组α-银环蛇毒素的纯品。参考文献报道的方法从天然的银环蛇毒干粉中分离纯化得到了天然α-银环蛇毒素的纯品。然后以天然α-银环蛇毒素为对照来检测重组α-银环蛇毒素的抗原性和毒性。ELISA结果显示其具有与天然α-银环蛇毒素相似的抗原性,以小鼠为动物模型,纯化的重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素相比,其腹腔注射的LD50也基本一致,约为0.22μg/g。结果表明利用基因工程的方法生产蛇神经毒素是可行的。     

阿片和尼古丁受体可调节人肺癌细胞株的生长

吸烟及尼古丁成瘾与肺癌发病关系密切;但尼古丁及其致癌衍生物的作用机理尚未阐明。最近发现,不同组织类型肺癌细胞株的胞膜上均能表达高亲和性的μ、δ和κ阿片受体、左旋尼古丁受体,以及α-环蛇毒素受体。这些受体的数目等于甚至多于它们在哺乳动物脑中所表达的数量。给予尼古丁     

重组α-银环蛇毒素P22-A31的原核表达及功能分析

α-银环蛇毒素在神经科学研究以及在临床和制药上有重要作用,为获得大量的α-银环蛇毒素,我们用已构建的pGEX-BgTX(P22-A31)质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并用谷胱甘肽Sepharose FF纯化GST-α-银环蛇毒素融合蛋白,再用凝血酶切掉融合标签谷胱苷肽转移酶(Glutathione S-transferase,GST),得到了较纯的重组α-银环蛇毒素同工毒素,得率约为1.225mg/L。用重组α-银环蛇毒素制备多克隆抗体,经ELISA和Western杂交鉴定后可知重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素的抗原性一致。小鼠毒性试验表明,重组α-银环蛇毒素同工毒素的半致死剂量LD50为1.598mg/kg,约为天然α-银环蛇毒素的1/5。小鼠化学法镇痛试验显示,重组α-银环蛇毒素有一定的镇痛药效,1/4LD50剂量的镇痛百分率为55.2%,1/8LD50剂量的镇痛百分率为20.5%,在外周镇痛作用中呈一定的量效关系。     

重组α-银环蛇毒素的纯化及活性分析

以表达重组α-银环蛇毒素的高效表达菌株BL21(PDZ04)为材料,研究重组α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)的分离纯化.采取亲和色谱和离子交换色谱的方法都得到了重组α-银环蛇毒素的纯品.首先从天然的银环蛇毒干粉中分离纯化得到了天然α-银环蛇毒素的纯品.然后以天然α-银环蛇毒素为对照来检测重组α-银环蛇毒素的抗原性和毒性.ELISA结果显示其具有与天然α-银环蛇毒素相似的抗原性,以小鼠为动物模型,纯化的重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素相比,其腹腔注射的LD50也基本一致,约为0.22μg/g.结果表明利用基因工程的方法生产蛇神经毒素是可行的.     

蛇毒α—神经毒素及其基因研究进展

蛇毒 α-神经毒素 ( α- neurotoxin,α- NT)是神经毒类毒蛇咬伤中毒主要致死毒素。该毒素作用于突触后运动终板 N型乙酰胆碱受体 ( Ach R) ,α-NT与 Ach R结合后 ,阻止神经肌肉的去极化而引起神经传导阻断 ,导致临床上出现神经肌肉麻痹 ,甚至自主呼吸停止而死亡。然而研究蛇毒α- NT是蛋白质化学、分子毒理学及基因工程等方面课题研究较为理想的材料 ,因为其分子量较小、活性强、理化性质稳定等特点备受广大科学家青睐。作为Ach R受体研究工具 ,特别是近年来发现其具有较多的药理作用后更是加速了其分离纯化以及基因工程生产这一毒素…     

丁氏双鳍电鳐电器官乙酰胆碱受体膜微囊的分离

本文报告了从丁氏双鳍电鳐电器官中分离纯化膜结合烟碱样乙酰胆碱受体的简便方法。比活性达1750nmolα-毒素结合点/克蛋白质,无乙酰胆碱酯酶活性,可避免它的干扰。电镜检查发现受体的膜结合物成微囊状,直径约0.1—0.3μα-毒素结合试验及聚丙烯酰胺凝胺电泳结果证明具有烟碱样胆碱能受体性质,适于受体功能和性质的研究。     

中国南海堂皇芋螺毒素基因克隆及两个毒素的合成及活性研究

目的 研究中国南海堂皇芋螺(Conus imperialis)毒素基因序列,为毒素功能研究奠定基础。方法 采用Trizol法提取堂皇芋螺毒腺管的总RNA,应用3’端快速扩增cDNA末端(3’RACE)及巢式PCR技术,获得A、O、J超家族芋螺毒素新序列;或以A家族高度保守的内含子及3’端非翻译区(3’UTR)设计引物,克隆出新的α-芋螺毒素新序列。选择合成毒素ImIIA及Im1.2,测定ImIIA二硫键的连接方式,并测定两种毒素对神经型烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的抑制活性。结果 获得11条毒素前体肽序列,分属A、O1、O2、J3等超家族,其中Im1.95为已报道芋螺毒素,其余为新发现芋螺毒素。ImIIA二硫键连接方式为少见的“C1-C2,C3-C4”,10μmol/L Im1.2、ImIIA对α2β2、α2β4、α4β2、α3β2、α3β4 5个nAChR亚型抑制活性较低。结论 通过基因克隆方法,从堂皇芋螺中获得了11个芋螺毒素,其中10个为新序列,属于A、O1、O2、J3等超家族毒素,Im1.2、ImIIA对神经型nAChR各受体亚型活性较低。     

新型α-芋螺毒素Di1.1的克隆、合成及功能研究

目的：从中国南海长距芋螺中克隆出新的芋螺毒素序列并用固相方法合成该毒素,测定其折叠后的二硫键配对方式并初步研究其药理学特性。方法：根据芋螺毒素A超家族保守的信号肽序列设计引物,通过3＇-RACE扩增,从芋螺毒腺管中克隆出新的毒素基因;采用Fmoc-固相法合成线性多肽,通过空气氧化折叠获得含二硫键的折叠产物,用两步氧化折叠法测定多肽的二硫键连接方式;用双电极电压钳技术初步研究其药理学特性。结果：发现-种新的α-芋螺毒素Dil．1的cDNA序列,其成熟肽序列为CcVIESCHSNHIDECES;该肽二硫键连接方式以C1-C4、C2-C3为主,以C1-C3、C2-C4连接为辅,对烟碱型乙酰胆碱受体各亚型活性较弱。结论：Dil．1是-种新的α4／7型芋螺毒素,其折叠方式以C1-C4、C2-C3连接为主。     

新型α-芋螺毒素基因克隆的引物筛选

目的:优化PCR条件,建立能特异扩增出α-芋螺毒素基因片段的最理想PCR条件.方法:根据α-芋螺毒素基因保守的信号肽或内含子序列和非翻译区保守核苷酸序列设计了多组特异引物,并对引物浓度和退火温度等影响因素进行优化.结果:根据α-芋螺毒素基因保守的内含子序列为引物、引物浓度为0.1 μmol/L、退火温度为50℃时,能特异的扩增出α-芋螺毒素基因片段,分子量大约分别为180bp和300bp.结论:采用优化的PCR条件,能筛选出克隆新型的α--芋螺毒素基因片段的最理想引物,为α-芋螺毒素的化学合成、活性研究和应用提供基础.     

新芋螺毒素基因的克隆及其遗传进化分析

全世界有约800种芋螺,每种芋螺产生多达2 000种的肽类毒素,这些毒素可以作用于电压门控离子通道(Na+,K+,Ca2+)、配体门控离子通道(n ACh Rs,5-HT3R,NMDAR)、G蛋白偶联受体(神经降压素和血管加压素)和神经递质转运蛋白。虽然已有大量的芋螺毒素通过毒液分离、c DNA克隆和转录组测序获得,但已发现的芋螺毒素不足其总量的0.5%。A-超家族中α-芋螺毒素基因结构包含了一个内含子和被该内含子分开的两个外显子,成熟肽具有标准的4个半胱氨酸骨架(CC-C-C)。本研究利用具有保守性的α-芋螺毒素基因内含子序列,采用多个PCR退火温度,从海南产疣缟芋螺中克隆到了1个新的具有6个半胱氨酸骨架(CC-C-C-CC)的M-超家族芋螺毒素基因和1个含有5个半胱氨酸新颖骨架(CC-C-C-C)的未知新家族芋螺毒素,并对它们的基因结构、成熟肽序列,以及与其他M-超家族芋螺毒素的遗传进化关系进行了深入分析。首次证实保守的α-芋螺毒素基因内含子序列可能存在于其他超家族中。     

α-银环蛇毒素同工毒素基因的克隆和表达

α-银环蛇毒素是存在于银环蛇蛇毒中的一种长链神经毒素,能与神经递质受体特异性结合,因此它不仅是神经信号传导机制研究的重要分子探针,更具有开发治疗某些神经性疾病新型药物的可能性。用SMART技术,反转录合成银环蛇毒腺cDNA,克隆并测定了α-银环蛇毒素基因,得到14种mRNA序列;进而将其中一种新的α-银环蛇毒素基因亚克隆到原核表达载体pQE30a和pGEX-4T-1中,在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达,其中带有GST融合蛋白的重组质粒α-BgTX(P22-A31)／pGEX-4T-1在BL21菌株中得到高效表达,表达量占菌总蛋白的30％,可溶形式存在的融合蛋白大于25％。     

金环蛇神经毒素与乙酰胆碱受体结合的特点

进一步纯化了前一工作中从广西省产金环蛇(Bungarus fasciatus)蛇毒分离的突触后毒素Ⅰ和Ⅱ。以超饱和剂量的毒素Ⅰ或Ⅱ先与从电鳐(Narcine maculata)电器官得到的乙酰胆碱受体(AChR)保温10min 或 lh,再加入~(125)Ⅰ-标记α-银环蛇毒素或~(125)Ⅰ-标记眼镜蛇毒素,继续保温10min 或 lh,由测定与 AChR 结合的放射性强度得知,如以未经毒素Ⅰ或Ⅱ预饱和的放射性强度为100%,则经与其一预饱和者的约为30%,即毒素Ⅰ或Ⅱ只竞争地阻遏了α-银环蛇毒素或眼镜蛇毒素与 AChR 结合能力的2/3左右。文中讨论了存在两种类型 AChR 的可能性。     

α2-肾上腺素受体对大鼠肠系膜动脉床降钙素基因相关肽释放的调节作用

降钙素基因相关肽（CGRP）从感觉神经末梢的释放受多种机制的调节。本文在离体灌流的大鼠肠系膜动脉床组织上,利用药理学工具药,研究了α2-肾上腺素受体对CGRP的基础和内毒素刺激后释放的作用。结果发现,α2-受体激动剂UK14304（3×10－6mol／L）可以显著抑制CGRP的基础释放和内毒素（1～5μg／ml）刺激后的释放,抑制幅度为22％～42％;用α2-受体拮抗剂Yohimbine（10－5mol／L）可以完全阻断UK14304的作用。结果表明突触前α2-受体对CGRP从外周阻力血管组织的释放,尤其是内毒素刺激后的释放具有抑制作用,在内毒素休克晚期,α2-受体功能减低可能介导了外周组织CGRP的过量释放。     

雌激素受体β共调节因子的研究进展

雌激素受体(ER)包括α和β等2种,均为核受体。ERβ在乳腺癌预后和激素治疗耐受中有重要意义,其活性受与之相互作用的共调节因子的影响。这些共调节因子有的能与2种ER发生作用,有的只能特异地作用于其中一种。本文简要综述了与ERβ相互作用的共调节因子的相关研究进展。     

实验性哮喘时肺的α-受体增加和β-受体减少

近些年来不断报道α-受体和β-受体在哮喘发病中的作用,提出了哮喘发病的β-受体阻断和α-受体功能亢进的假说。最近,P.J.Barnes 等发现实验性哮喘动物肺中α-受体增加,β-受体减少,进一步支持上述假说。实验性哮喘动物模型系用卵蛋白致敏豚鼠后,再用卵蛋白反复攻击所造成,均有喘、咳、呼吸困难、青紫和气道高敏性等症状。取这种豚鼠和正常豚鼠的肺制备匀浆,用放射标记结合分析法测定肺匀浆中的α-受体和β-受体的数量及它们的比例。还测定肺匀浆中腺苷酸环化酶的活性,以确定β-受体对β-受体激动剂的敏感性。结果发现,实验性哮喘动物肺匀浆中α-受体数量为对照动物的两倍(P<0.001),β-受体数量则低于对照动物(P<0.05)。在实验性哮喘动物肺匀浆中,α:β受体结合部位的比例为1:12,在对照动物则为1:30。