高产α-转移葡萄糖苷酶菌株的诱变选育研究

α-转移葡萄糖苷酶是生产低聚异麦芽糖的关键酶。该文成功筛选了2株产α-转移葡萄糖苷酶菌株。在此基础上,进行了菌株的诱变选育和遗传稳定性试验,确定2株产酶酶活较高的突变株,有望将来应用于低聚异麦芽糖的生产中。     

代谢工程改造酿酒酵母生产β-胡萝卜素

β-胡萝卜素在食品、药品和化妆品领域有广泛用途。为获得生产β-胡萝卜素的微生物细胞工厂,本研究首先在酿酒酵母BY4742中过表达甲羟戊酸(MVA)途径的限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因及二萜化合物合成的关键酶牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(GGPS)基因,来提高牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)的供给。在酿酒酵母底盘菌BY4742-T2的基础上整合来源于成团泛菌和红法夫酵母的β-胡萝卜素合成基因,比较酿酒酵母工程菌生产β-胡萝卜素的差别。结果表明提高酿酒酵母中HMGR和GGPS酶基因的表达能将工程菌中β-胡萝卜素的产量提高26.0倍。另外,来源于真核生物红法夫酵母的合成基因相比成团泛菌,更有利于酿酒酵母生产β-胡萝卜素。最终获得的酿酒酵母工程菌BW02能生产1.56 mg/g细胞干重的β-胡萝卜素,为进一步获得高产β-胡萝卜素细胞工厂提供基础。     

β-呋喃果糖苷酶的固定化及其在低聚乳果糖合成中的应用

【目的】探索适宜的树脂作为载体固定β-呋喃果糖苷酶,并研究该固定化酶催化合成低聚乳果糖。【方法】选择9种大孔吸附树脂和碱性离子交换树脂固定β-呋喃果糖苷酶,筛选固定化效果较好的树脂作为载体。用聚乙烯亚胺(PEI)修饰得到PEI-树脂,采用吸附法将酶固定于PEI-树脂上,并对固定化条件进行优化。考察固定化酶的重复使用稳定性及其催化合成低聚乳果糖的能力。【结果】通过筛选发现大孔阴离子交换树脂D311固定化效果较好,经过PEI修饰后,D311固定化效果显著提高。用PEI修饰的载体PEI-D311固定果糖苷酶,最优固定化条件为:PEI浓度2%,加酶量103 U/g,吸附温度25°C,吸附p H 6.0-8.0,吸附时间8 h。最优条件下固定化酶活达57 U/g,酶活回收率达55.3%。用固定化酶催化水解1 mol/L蔗糖,重复利用15批载体酶活没有明显降低。用固定化酶催化合成低聚乳果糖,8 h内低聚乳果糖产量最高达到137 g/L。【结论】PEI-D311固定的果糖苷酶具有较好的重复使用稳定性及较高的低聚乳果糖合成能力,这为固定化酶法生产低聚乳果糖研究奠定了基础。     

解淀粉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效表达

目的:克隆解淀粉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglA)使其在解淀粉芽孢杆菌CICIM B4081中高效表达,并对重组酶进行酶学性质研究.方法:以解淀粉芽孢杆菌(CICIM B4801)染色体DNA为模板,经过PCR扩增得到了大小约为0.8kb的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglA),构建了重组表达质粒pQ-bglA,通过电转化的方法将其转化人解淀粉芽孢杆菌(CICIM B4801)中.结果:得到了能高效表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶的重组解淀粉芽孢杆菌.在250mL摇瓶条件下,重组菌分解地衣多糖的胞外最高酶活达到了1515.7U/mL,重组酶的最适作用温度为55℃,最适反应pH值为6.5.结论:重组菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活为原始菌株的11.84倍,实现了bglA基因在解淀粉芽孢杆菌中的高效表达.     

低聚异麦芽糖生产工艺研究

摘要：低聚异麦芽糖是一种功能性低聚糖,因其具有多种独特生理功能,被广泛地应用于食品、医药、饲料等领域,市场前景十分广阔,但是目前低聚异麦芽糖生产工艺中存在许多不足之处。本文首先介绍了低聚异麦芽糖的性质和生理功能,其次阐述了低聚异麦芽糖的生产工艺,并对如何构建和利用基因工程菌生产低聚异麦芽糖提出展望。     

β-半乳糖苷酶酶学性质及其在低聚半乳糖合成中的应用

研究乳酸克鲁维酵母所产β-半乳糖苷酶的酶学性质及低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)的酶法合成条件。利用高效液相色谱法进行检测,以GOS(聚合度n3)生成量为指标,考察温度、pH、金属离子种类和浓度对酶活性的影响,以及K+存在时,底物浓度、反应时间、加酶量对乳糖转化率及GOS生成浓度的影响。结果表明:一价离子对β-半乳糖苷酶转糖苷活性具有促进作用,其中K+、NH+4对水解活性同样起促进作用,而Na+起抑制作用;制备低聚半乳糖的最佳工艺条件为37℃、pH8.0、K+0.08mol/L、初始乳糖质量浓度500g/L、反应时间5h、加酶量10μL/g乳糖,此条件下低聚半乳糖的生成质量浓度达到94.74g/L。     

重组β-环糊精葡萄糖基转移酶生产β-环糊精的工艺条件优化

将来自于Bacillus circulans 251的β-CGTase编码基因克隆到表达载体pET-20b(+),转化Escherichia coli BL21(DE3)。经酶活检测培养基上清中的β-CGTase酶活为20 U/mL。对酶转化淀粉生成β-环糊精的反应条件进行了优化,结果表明,当底物马铃薯淀粉浓度15%,反应初始pH5.5,温度30℃,加酶量10 U/g干淀粉,环己烷浓度2.5%-5%(V/V),转化周期24 h,β-环糊精转化率达到最高值75.3%,是国内外报道的酶法生产β-环糊精的最高水平。     

蔗糖异构酶PalI在解脂耶氏酵母中的表面展示

【背景】蔗糖异构酶(PalI)生物转化蔗糖是目前生产异麦芽酮糖的主要方法,但在生产过程中存在的蔗糖异构酶转化蔗糖副产物比例较高、游离酶需要分离纯化等问题限制了异麦芽酮糖工业生产的应用。【目的】构建蔗糖异构酶PalI在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) Po1g中的表面展示菌株,以降低蔗糖异构酶转化蔗糖的副产物比例及其纯化成本。【方法】为获得具有生产PalI能力的Y.lipolytica Po1g表面展示菌株,通过重叠延伸PCR将克雷伯氏菌(Klebsiella singaporensis)LX3的PalI的编码基因PalI与全基因合成的来自Y.lipolytica细胞壁的锚定蛋白Pir1融合,转入Y.lipolytica Po1g中构建表面展示菌株。利用3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)比色定糖法测定表面展示的PalI酶活力并对其酶学性质进行探究,通过高效液相色谱法分析其转化蔗糖的产物。【结果】构建了蔗糖异构酶表面展示菌株Pir1-PalI/Po1g,经DNS法测得展示在Y. lipolytica Po1g表面的Pal...     

共表达N-乙酰转移酶提高Aspergillus nidulans α-葡糖苷酶在毕氏酵母中的表达研究

葡糖苷酶以低聚寡糖为底物,通过切割非还原末端α-1,4糖苷键以获得葡萄糖基,同时转苷生成α-1,6糖苷键,广泛应用于低聚异麦芽糖生产、代谢生理研究、疾病预防治疗等各个领域。Aspergillus nidulans来源的α-葡糖苷酶在毕氏酵母中外源表达时存在酶活较低、蛋白质降解等问题,为进一步提高α-葡糖苷酶表达量,共表达N-乙酰转移酶(Mpr1)以降低发酵过程细胞受到的氧化胁迫,提高酶活。以实验室保藏的P. pastoris KM71/pPIC9K-AgbB为出发菌株,构建共表达菌株Pichia pastoris KM71/pPIC9K-AgbB/pPICZA-Mpr1,经过摇瓶发酵120h,α-葡糖苷酶转苷酶酶活和蛋白质含量可达22. 56U/ml和0. 52mg/ml,分别是出发菌株摇瓶产酶的1. 92倍和1. 27倍。在此基础上进行3. 6L罐发酵温度和甲醇诱导浓度优化,在25℃,以1%的甲醇浓度诱导发酵最高酶活和蛋白质含量可达128. 12U/ml和1. 81mg/ml,分别是起始菌株上罐产酶的1. 96倍和1. 50倍。     

发酵乳杆菌来源4,6-α-葡萄糖基转移酶的酶学表征及产物性质鉴定

4,6-α-葡萄糖基转移酶 (4,6-a-GTs) 能以直链淀粉为底物合成含a(1-6) 键的a-葡聚糖,在酶法合成膳食纤维中具有很大的应用潜力。根据4,6-a-GTs氨基酸序列中的保守区段设计引物,从发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum基因组中PCR扩增得到一条假定GTFB-like 4,6-a-GTs基因 (命名为gtf16),构建重组质粒pET15b-gtf16并在宿主大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 成功表达,纯化后对其进行酶学表征。结果表明,该酶最适pH为5.0,最适温度为40 ℃。通过薄层色谱、NMR光谱、水解酶水解等检测手段对Gtf16酶转化产物进行系统的表征,发现其产物具有以下特征：与已报道的来源于罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri 121菌株的4,6-α-葡萄糖基转移酶-GtfB与直链淀粉作用后的产物异麦芽寡糖结构类似;产物键型中a(1-6) 键占比可达75%,产物平均分子量为23 793 Da;产物被消化酶水解后得到的抗消化成分含量可达88.22%。     

能分泌活性α-淀粉酶(鼠胰)的稳定的酵母转化株

将鼠胰α-淀粉酶的cDNA插入酵母穿梭质粒,并位于啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的MFα1基因编码序列的启动子和分泌信号肽的后面。经这种重组质粒转 化的啤酒酵母即能合成和分泌有活性的α-淀粉酶,该酶能有效地水解培养基中的淀粉。已从不同的酵母株系得到遗传稳定的分解淀粉的细胞株。意味着可用酵母直接转化淀粉原料为酒精,在生产上这是很有意义的一步。     

反刍兽月形单胞菌β-木糖苷酶基因在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质

β-木糖苷酶(β-xylosidase,酶编号EC 3.2.1.37)是木聚糖降解酶系中的重要组成部分。本研究以毕赤酵母Pichia pastoris GS115为宿主菌尝试表达反刍兽月形单胞菌Selenomonas ruminantium中的β-木糖苷酶基因Sxa。根据毕赤酵母对密码子的偏爱性、mRNA二级结构、GC含量和稀有密码子,对Sxa基因进行优化;通过基因合成技术获得了全长基因mSxa并构建重组酵母表达载体pPIC9K-mSxa;以BglⅡ酶切重组载体pPIC9K-mSxa,电击转化将m Sxa基因导入毕赤酵母GS115中,获得的转化子经过表型和遗传霉素G418抗性筛选、PCR鉴定,得到表达β-木糖苷酶基因的工程菌GS115-pPIC9K-mSxa;通过活性测定获得高效表达β-木糖苷酶的重组酵母,并对重组β-木糖苷酶的酶学性质进行了初步研究。结果表明,重组β-木糖苷酶的分子量约为66 kDa。在发酵罐水平表达的酶活性达到了287.61 IU/mL。对酶学性质研究显示,该酶在温度为40-60℃,pH为5.0-7.0时较稳定,其最适反应温度和pH分别为55℃和6.0,专一性地作用于β-木糖苷键。Mn~(2+)和Ca~(2+)对该酶具有激活作用,而Fe~(3+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Mg~(2+)、EDTA及SDS抑制其酶活性。本研究首次将反刍兽月形单胞菌的β-木糖苷酶基因转化到毕赤酵母中获得表达,并具有较高活性,为进一步工业化应用奠定了基础。     

酿酒酵母中高效积累β-胡萝卜素的代谢途径构建

β-胡萝卜素是一种橘黄色的脂溶性色素，属于类胡萝卜素家族，基于其丰富的生物学活性，在食品、医药、化妆品等领域具有广泛的应用。国内外对β-胡萝卜素市场需求量巨大，特别是天然来源的β-胡萝卜素具有广阔的市场前景，建立适合天然β-胡萝卜素生产的微生物细胞工厂显得尤为重要。本研究利用基因工程手段克隆了β-胡萝卜素生物合成途径中的三个基因，分别是来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因(ScBTS1)、红法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)的八氢番茄红素脱氢酶基因(XdCrtI)以及同时具有八氢番茄红素合成酶和番茄红素环化酶的双功能酶基因(XdCrtYB),构建组成型表达载体pYES2-Kan-CrtI-CrtYB-BTS1,并转化至酿酒酵母MKP-o中，最终筛选获得能够生产β-胡萝卜素的酿酒酵母基因工程菌株。结果显示，此工程菌摇瓶产量达到14.53 mg/g细胞干重(DCW)且发酵周期短，不仅可以稳定高效地积累β-胡萝卜素，同时发酵过程中无需添加诱导剂，有利于节约生产成本。因此，可以将其作为一株具有较高β...     

β-半乳糖苷酶的筛选、克隆表达、酶学性质及其酶法合成低聚半乳糖

采用人工底物邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o NPG)为筛选标记,从耐有机溶剂微生物菌库中,筛选出具有较高水解活性的β-半乳糖苷酶产生菌,再以乳糖为底物考察菌株低聚半乳糖的合成性能,筛选得到1株产β-半乳糖苷酶的Erwinia billingiae WX1。根据Gen Bank中相同属种的基因组序列推测β-半乳糖苷酶基因,克隆得到β-半乳糖苷酶基因gal,并在大肠杆菌中实现了来源于Erwinia billingiae菌β-半乳糖苷酶的克隆表达。该基因的开放阅读框(ORF)为1 428 bp,编码475个氨基酸,理论相对分子质量为5.2×104。镍柱法分离纯化得到电泳纯的β-半乳糖苷酶GAL,其酶学性质研究表明最适催化温度55℃,最适p H 7.0;Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶起较强促进作用,EDTA对该酶抑制作用较强。利用β-半乳糖苷酶GAL的转糖基作用,以乳糖为底物合成低聚半乳糖,初步优化的反应条件:底物乳糖质量浓度400 g/L,每克乳糖添加酶量1.0 U,在40℃反应16 h后,低聚半乳糖合成率达到34%(质量分数),显示了较好的开发前景。     

坚强芽孢杆菌β-淀粉酶基因的核苷酸序列分析

淀粉水解酶广泛用于淀粉加工业中,何秉旺等在选育产耐热β-淀粉酶菌株中得到一株坚强芽孢杆菌（Bacillusfirmus）725,该菌株产生的淀粉酶有较好的热稳定性,水解淀粉的主要产物为麦芽糖。自然菌株产生的淀粉酶往往是多种淀粉酶的混合,为进一步研究该菌株产生的淀粉酶的性质和在工业上应用的可能性,分离了三个淀粉酶基因,在大肠杆菌中克隆和表达[1]。其中重组质粒pBA150产生的淀粉酶的淀粉水解产物主要是麦芽糖［1］。β-淀粉酶（EC.3．2.1．2）水解淀粉的主要产物是麦芽糖,工业上可用于生产高麦芽糖浆,近年来又有β-淀粉酶用于啤酒工业的报道[2]。本文报道重组质粒pBA150的β-淀粉酶基因的序列分析及推导出的氨基酸序列同己知β-淀粉酶的氨基酸序列比较。     

坚强芽孢杆菌β-淀粉酶基因的核苷酸序列分析

淀粉水解酶广泛用于淀粉加工业中,何秉旺等在选育产耐热β-淀粉酶菌株中得到一株坚强芽孢杆菌（Bacillusfirmus）725,该菌株产生的淀粉酶有较好的热稳定性,水解淀粉的主要产物为麦芽糖。自然菌株产生的淀粉酶往往是多种淀粉酶的混合,为进一步研究该菌株产生的淀粉酶的性质和在工业上应用的可能性,分离了三个淀粉酶基因,在大肠杆菌中克隆和表达[1]。其中重组质粒pBA150产生的淀粉酶的淀粉水解产物主要是麦芽糖［1］。Β-淀粉酶（EC.3．2.1．2）水解淀粉的主要产物是麦芽糖,工业上可用于生产高麦芽糖浆,近年来又有β-淀粉酶用于啤酒工业的报道[2]。本文报道重组质粒pBA150的β-淀粉酶基因的序列分析及推导出的氨基酸序列同己知β-淀粉酶的氨基酸序列比较。     

藤黄微球菌海藻糖生物合成基因的克隆与鉴定

首次从一株能利用淀粉产生海藻糖的藤黄微球菌中克隆了海藻糖生物合成基因。采用PCR方法结合非随机鸟枪法得到藤黄微球菌中低聚麦芽糖苷基海藻糖合成酶(MTSase)基因(MtreY)的全序列及低聚麦芽糖苷基海藻糖水解酶(MTHase)基因(MtreZ)的部分序列,其中MtreY共有2,370个碱基,编码789个氨基酸,表达产物分子量为86·7kD。同源性分析表明,与已报道的MTSase和α-淀粉酶家族成员具有相同的保守模体。将MtreY基因在大肠杆菌JM83中表达,证明表达产物具有预期的酶活性。     

树脂固定化β-半乳糖苷酶制备低聚半乳糖

以树脂为载体研究β-半乳糖苷酶固定化条件,来改善酶性质。以吸附率和回收率最高的离子交换树脂I002为载体,通过先吸附后交联的方法固定β-半乳糖苷酶,优化固定化条件。结果表明:加酶量为51.8 U(以1 g树脂计),固定p H为6.5,温度是25℃,吸附时间12 h,戊二醛体积分数为4%,交联温度是40℃,时间是6 h时,固定化效果最好。获得的固定化酶活可达16.2 U,固定酶回收率为39.1%,得到低聚半乳糖(GOS)的产率为24.2%。该研究为工业化利用固定化乳糖酶连续生产低聚半乳糖提供了技术依据。     

产β-淀粉酶菌株的筛选

β-淀粉酶水解淀粉是从淀粉分子的非还原性末端开始,水解相隔的α-1,4-葡萄糖苷键,产生麦芽糖。β-淀粉酶最初发现在高等植物中,特别是大麦、小麦等谷物中。甘薯和大豆中也含有β-淀粉酶。该酶主要用于酿酒和生产饴糖。近几年来,国外有一些关于由微生物产     

α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型的建立及其应用

【目的】针对人α-麦芽糖苷酶这个糖代谢途径中重要的靶蛋白,建立α-糖苷酶抑制剂高通量筛选模型。【方法】采用毕赤酵母表达系统克隆和表达人α-麦芽糖苷酶。利用酶的催化特性建立α-糖苷酶抑制剂筛选模型。应用该模型对放线菌代谢产物库进行高通量筛选。通过构建16SrRNA系统发育树分析阳性菌株的分类地位。【结果】首次成功克隆、表达了具催化活性的人α-麦芽糖苷酶N端结构域。针对人α-麦芽糖苷酶N端催化结构域,建立α-糖苷酶抑制剂的筛选模型。对包含近2000株放线菌代谢产物的天然产物库进行高通量筛选,最终得到20株α-麦芽糖苷酶抑制剂生产菌株。其中19株放线菌为链霉菌属,且在分类学上具有丰富的多样性。【结论】本研究建立的α-糖苷酶抑制剂高通量筛选模型具有很强的实用价值,可用于新型糖苷酶抑制剂类降糖药物的开发。