链霉菌11371基因工程宿主菌的确定

为消除链霉菌11371内源性质粒对pIJ702的限制,以提高pIJ702转化率,确定11371基因工程宿主菌。采用种内接合转移的方法对链霉菌11371衍生菌U3和P2、P5、P7进行内源性质粒的消除。获得接合转移子U3-P7-6,具有转化外源质粒的能力,转化率为17～20个/100个菌,为链霉菌11371转化体系构建、克隆基因结构、功能鉴定和基因定位等研究提供生物材料。     

庆丰链霉菌的致死接合现象

庆丰链霉菌各种衍生菌株的平板或斜面能自发产生麻点现象(pock),而当种内或种间杂交时,这种现象出现得更频繁。从麻点中心和周围孢子中可分别分离到具有产生麻点能力的菌株(Ltz~+)和本身虽然不能产生麻点但却可以作为检测麻点产生的指示菌株(Ltz~-)。 本文的研究结果表明,庆丰链霉菌的麻点现象是Ltz~+菌株和作为指示菌的Ltz~-菌株细胞之间在接合过程中的一种致死接合作用(lethal zygosis),致死率可达99％以上。决定这种致死能力的遗传因子能感染转移,可用已知质粒消除因子(如吖啶黄、高温预培养)处理及原生质体再生过程诱发消除。据此,我们认为庆丰链霉菌中产生麻点的能力很可能由质粒基因所决定。对于这种质粒的可能来源进行了讨论。     

高温链霉菌质粒pTSC2的测序分析和滚环复制方式的鉴定

从猪粪堆肥中分离到一株编号为X3-3的可以在50℃高温生长的链霉菌菌株,该菌株含有一个约7kb的环型质粒pTSC2。【目的】克隆、测序和分析pTSC2,以及鉴定质粒的复制方式。【方法】利用分段克隆和引物延伸获得pTSC2的全序列,利用多序列比对寻找复制元件rep、dso和sso,利用中性转移和Southern杂交检测复制中间体。【结果】克隆和测序获得了全长为7516bp的pTSC2序列,预测编码8种蛋白,其中4种蛋白与链霉菌滚环复制的质粒pIJ101中负责复制和接合转移的蛋白非常相似。pTSC2的复制元件rep、dso和sso也与pIJ101的相似。克隆、转化变铅青链霉菌ZX7以及高温链霉菌2C证明了rep和dso为复制所必需元件。Southern杂交检测到pTSC2复制过程中积累了大量的单链DNA。【结论】高温链霉菌质粒pTSC2以滚环方式进行复制。这是首次在高温链霉菌中克隆和测序质粒,以及鉴定其复制方式。     

黑暗链霉菌DNA转移系统的建立

研究了黑暗链霉菌的基因转移系统,探索了通过PEG介导的原生质体转化、接合转移向黑暗链霉菌中转入外源DNA的可能性。多次尝试用质粒pIJ702转化黑暗链霉菌9904原生质体均未成功。对原生质体进行“热处理”后转化、利用单链DNA转化等都不能将质粒导入黑暗链霉菌中,表明黑暗链霉菌对外源DNA有很强的限制修饰作用。利用接合转移将具有oriT的大肠杆菌链霉菌穿梭质粒pHZ132转入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中,获得供体菌ET12567(pUZ8002,pHZ132)。将供体菌与预萌发的黑暗链霉菌9904的孢子进行接合转移,成功地将pHZ132转入黑暗链霉菌9904中。质粒pHZ132经黑暗链霉菌自身修饰后也可转入黑暗链霉菌9904菌株的原生质体中,转化率约为103/μg DNA(pHZ132)。     

质粒在大肠杆菌和链霉菌和FR-008之间的属间接合转移

tIJ8154是由链枪菌一大肠杆菌双功能穿梭载体pGM160衍生而来的．本文报道这个质粒从携带RP4的大肠杆菌细胞中向革兰氏阳性细菌一链霉菌FR-008中的转移．从两种宿主中分别提取质粒DNA,进行琼脂糖凝胶电泳,发现pIJ8154的结构在两种亲缘关系甚远的宿主中均是稳定的,这种接合转移的方法已经成为向链霉菌FR-008中转移基因的一种手段．     

链霉菌高拷贝质粒pIJ101的研究 V．两个拷贝数突变子及其与克隆片段的关系

在分离和定位链霉菌高拷贝质粒PlJ101上启动子活性区域的过程中,我们将Bc11-E片段经MboI进一步酶解后,克隆到由pIJ101基本复制功能区所衍生的载体pIJ425的BgIII位点上,从转化酶、铅青链霉菌TK64以原生质体所获得的硫链丝菌素抗性转化子中,发现了两个拷贝数极其异常的衍生质粒,命名为PI J2743和PIJ2744。与plJ425相比,pIJ2743的拷贝数增加约10倍,而pIJ2744的拷贝数则降低约10倍。拷贝数的剧增和剧减不是由于质粒宿主的突变,因为它们在重新转化的宿主中仍显示了突变型拷贝数特征。拷贝数的变化也不是由于载体的突变,因为切除插入片段后,载体区域再连接后的质粒仍与原始plJ425的拷贝数相同。将高拷贝突变子中0.63kb的插入片段以两种不同的取向克隆到另一个类似于pIJ425的载体p1J 486的BamHI位点,在一种取向插入时,新衍生的质拉仍显示出投高的拷贝数,而在另一种取向时,质粒的拷贝数不发生变化,说明拷贝数的剧增不仅只与插入片段有关,而且其功用具有明显的方向性,即为-顺式作用因子。     

一株红球菌(Rhodococcus sp.)二噁英降解质粒的稳定性与接合转移特性

【目的】考察一株红球菌Rhodococcus sp.strain p52中的二噁英降解质粒pDF01(170 kb)和pDF02(242 kb)的稳定性和接合转移特性。【方法】在无选择压力的条件下对菌株p52进行连续传代培养,考察质粒pDF01、pDF02的丢失;以菌株p52为供体菌,以不同种属的菌株作受体菌,通过平板接合实验探讨质粒pDF01、pDF02接合转移的受体菌范围以及接合转移频率,利用菌落杂交、Southern杂交对质粒转移结果进行确认,利用降解实验测试转移质粒降解基因的表达。【结果】质粒pDF01和pDF02在红球菌p52中均具有较高的稳定性,在LB培养基上连续传代少于47次时pDF02可保持,连续传代少于65次时pDF01可保持。质粒pDF01和pDF02具备在同属和属间接合转移的能力,可向受体菌——紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、大地两面神菌(Terrabacter tumescens)和节杆菌(Arthrobacter sp.)转移,其中以节杆菌作受体菌时质粒pDF01和pDF02接合转移频率最高,达到3.5×10~(-6)(接合子/受体菌);对节杆菌接合子质粒进行Southern杂交进一步确认了质粒pDF01、pDF02的存在。另外获得质粒pDF01、pDF02后的节杆菌接合子可以对二苯并呋喃高效利用,且降解能力与红球菌供体菌株p52相当。【结论】红球菌菌株p52可通过降解质粒转移强化生物修复过程,在去除环境中二噁英污染中具有良好的应用前景。     

RP4质粒及其带动的硫杆菌重组质粒psDt125在氧化硫硫杆菌中的接合转移

本实验选择了一种大肠杆菌(E.coli)和氧化硫硫杆菌(Thiobacillusthiooxidans)均能生长的接合培养基。以大肠杆菌E.coli C600(RP4)为供体,以氧化硫硫杆菌T.t-3为受体,通过接合,直接将RP4质粒转移到氧化硫硫杆菌中,其Km~r,Tc~r基因得到表达,但Ap~r基因不表达。再将RP4质粒反向接合转移到E.coliHB101上,其三个抗性基因均表达。并且利用RP4质粒的带动将硫杆菌重组质粒psDt125直接转入氧化硫硫杆菌,其Cm~r基因表达。从而为氧化硫硫杆菌的基因工程改造提供了一条简便可行的遗传信息转移途径。     

天蓝色链霉菌中分化发育基因参与同源性重组

在天蓝色链霉菌中,ＳＣＰ２＾＊质粒接合转移频率的快增长,ＳＣＰ２＾＊质粒介导的质粒同源性重组频率的快增长与气生菌丝的形成同步。在１株ｂｌｄ基因突变株中,３株ｗｈｉ基因突变株中,测定ＳＣＰ２＾＊质粒接合转移及其介导的质粒同源性重组,结果表明,除ｗｈｉＡ基因突变导致质粒接合转移频率不稳定外,其余３个基因突变对质粒接合转移不产生影响,但在所测定的４个基因突变株中,质粒同源性重组的频率降低超过１０掊。     

变铅青链霉菌内源线性质粒接合转移必需功能区的鉴定

通常细菌间环型质粒在接合转移过程中,单链质粒DNA在质粒内部“oriT”接合转移起始位点发生缺刻.随后,打开的单链质粒DNA通过细胞膜的Ⅳ型分泌系统转移到受体菌中.但是,链霉菌中的接合型线型质粒带有游离3′端,5′端与末端蛋白结合,因而不能以细胞-细胞间方式转移单链缺刻DNA.报道了变铅青链霉菌线型质粒SLP2衍生的环型质粒,与SLP2一样可以高频高效接合转移,并鉴定了接合转移功能区.质粒有效的接合转移功能区包含6个共转录的基因,分别编码一个Tra样的DNA转移酶、胞壁水解酶、2个膜蛋白(可以与ATP结合蛋白相互作用)和一个功能未知的蛋白质.从SalⅠR-/M-向SalⅠR/M宿主转移的质粒频率下降表明,线型和环型的质粒都是以双链的形式转移的.上述研究结果表明SLP2衍生的线型质粒和环型质粒以相似的与细胞膜/胞壁功能相关的机理进行接合转移.     

吸水链霉菌应城变种的四个内源质粒及其逐个消除的研究

在改良质粒DNA提取方法的基础上,从三种农用抗生素的同一产生菌——吸水链霉菌应城变种中同时发现四个内源质粒,用双向电泳技术确定了它们均为CCC构型,根据分子量从大到小的顺序将它们分别命名为pHZ1、pHZ2、pHZ3和pHZ4,与已知分子量的CCC质粒分子同步电泳估计它们的分子量依次分别为61kb、4.7kb、4.1kb和3.3kb,基于这四个内源质粒中至少部分个体可能为接合性质粒,可在没有某个质粒的衍生菌株的菌坪上形成“麻点”的假设,我们分离和鉴定了三个质粒逐个消除的10-22衍生菌株,并在光学显微镜下确证了二种类型的麻点。     

阿维链霉菌QL0827接合转移体系的建立

目的:建立工业生产菌株阿维链霉菌QL0827的接合转移体系。方法:优化接合转移条件,建立该菌株的接合转移体系;应用优化后的接合转移体系,将基因中断质粒导入该菌,定向敲除基因组上的序列;再将携带基因组上特定序列的整合型质粒和复制型质粒导入该菌体,建立该菌株的基因过表达体系。结果:相比标准的接合转移方法,优化后接合转移效率提高了近150倍,达到2.45×10-6;并成功地将pks3基因簇的部分序列删除。结论:建立了阿维链霉菌QL0827的接合转移体系。     

链霉菌小质粒pDYM4.3k的复制与接合转移

【目的】链霉菌(Streptomyces)X335是从西藏高原活拉山口分离到的,其中含有一个大小为4.3 kb的环型质粒pDYM4.3k。克隆、测序和分析pDYM4.3k,以及鉴定复制和接合转移的基因。【方法】通过克隆和引物延伸获得pDYM4.3k的全序列,利用比对分析推测基因的功能,通过Southern杂交检测复制中间体,利用平板杂交实验证明接合转移功能。【结果】克隆和测序获得了全长为4346 bp的pDYM4.3k序列,预测仅有3个基因,其中1个基因与链霉菌主要接合转移基因同源,另外2个为功能未知。鉴定新的基因orf1及其上游的约300 bp构成了质粒的基本复制区域。检测到质粒存在单链的复制中间体,表明它以滚环方式进行复制。实验证明pDYM4.3k在变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中具有接合转移功能。【结论】质粒pDYM4.3k可以滚环方式进行复制和在链霉菌之间进行接合转移。这是目前报道的最小的、具有游离复制和接合转移功能的链霉菌质粒。     

链霉菌和大肠杆菌穿梭质粒载体的构建

本文报道了链霉菌和大肠杆菌穿梭质粒载体pSE-3的构建;把具有双启动子的大肠杆菌的质粒pGEM-3与新霉素抗性基因启动子缺失的链霉菌的探针质粒pIJ486分别用BamHI和BglⅡ酶切,T4 DNA连接酶连接后转化到E.coli HB101(Amp(?),Neo(?)),所得重组质粒能强启动pIJ486质粒上的氨基糖苷磷酸转移酶基因(aph),并使新霉素抗性基因在大肠杆菌中得到强表达。此重组质粒被命名为pSE-3,当其转化到变青链霉菌TK54(Tsr(?),Neo(?))的原生质体前,新霉素抗性基因亦能得到强表达。酶切结果表明,构建的具有两个启动子的穿梭质粒载体pSE-3上有HindⅢ和EcoRI的单酶位点,拷贝数约为39。经再转化和传代50代等研究表明,穿梭质粒载体pSE-3在链霉菌和大肠杆菌中均是稳定的。为某些有应用价值的目的基因在大肠杆菌和链霉菌中的克隆与表达提供了一个有价值的穿梭质粒载体。     

草生欧文氏菌(E.herbicola)CSH1065质粒的重组标记及Fib基因的遗传转移

利用DNA分子克隆技术及遗传重组方法,在E.herbicola CSH1065质粒上插入了Km_R及Mob基因,利用细菌间的接合转移,使E.herbicola CSH1065质粒转移到E.coli HB101中,从而获得了E.herbicola CSH1065的Fib(fungi inhibition)基因在E.coli HB101中的表达,进一步证明E.herbicola CSH1065 Fib基因功能只涉及其细胞内的大质粒,与其染色体基因组无关,其黄色色素基因与Fib功能无关。这些结果还为DNA分子杂交方法所证实。     

用双供体接合技术向甲醇利用菌导入外源载体质粒pLA2917和pRK290

以大肠杆菌HB101(pLA2917或pRK290)为供体,甲醇利用菌为受体,借助于HB101(pRK2013),进行三株菌的膜上接合。通过改变接合实验条件,得到了12个能在选择培养基上连续传代的菌株,其中761-2-1、Jc-1、Jc-2、LM等4株菌稳定地获得了来自HB101的粘粒pLA2917或质粒pRK290;而且接合转移频率高达2×10~(-1)(单位:接合子/受体细胞,下同),最低为7×10~(-3),一般为4×10~(-2)左右,远大于抗药性(T~r_c)的自发突变率10~(-9)。经初步比较研究,这4株菌不同于已知的任何一株可用作宿主的甲醇利用菌。本文还讨论了接合时间长短对接合转移频率的巨大影响,以及这4株菌的某些特性与用途。     

细菌遗传学(续完)

质粒 质粒编码的特性 如前所述,质粒是环状的染色体外遗传因子,它可编码多种遗传信息,包括通过接合而自我转移(self-transfer)至其他细胞的信息.并非所有的质粒都能转移它们自己:非接合(non-conjugative)类质粒既不能编码供体的菌毛也不能进行转移.不过,它们可被存在于同一供体细胞内的其他接合性质粒所移动(mobilized).除了这种任选性的转移能力之外,所有的细菌质粒都含有其为在细胞分裂时自我复制及分离进入子细胞所必需的基本遗传信息.     

伤寒沙门菌耐药质粒体内接合转移的研究

目的研究伤寒沙门菌耐药质粒pRST98在小鼠体内向大肠埃希菌的接合转移,比较质粒在体内、外接合转移的异同。方法由于伤寒沙门菌是一种只对人类致病的病原菌,因此将伤寒沙门菌的耐药质粒pRST98导入遗传背景明确的鼠伤寒沙门菌低毒株RIA中,用接合子pRST98/RIA口饲BALB/c小鼠进行体内接合转移。结果在体外伤寒沙门菌很容易将pRST98转移给大肠埃希菌E.coliK12W1485(F-)RifrLac+,该接合子又可将pRST98转移给鼠伤寒沙门菌RIA,但在不同宿主菌中耐药标志的表达有差异。未经人工感染小鼠肠道分离的大肠埃希菌耐药情况严重,口饲pRST98/RIA后出现了部分耐药标志与pRST98耐药谱相同的大肠埃希菌,但有些抗生素的耐药标记未能表达。质粒检测显示体内形成的接合子均含耐药质粒pRST98。结论伤寒沙门菌耐药质粒pRST98在动物体内、外均可转移给大肠埃希菌,但同一质粒在体内、外大肠埃希菌株中耐药标志表达有差异,即使在同一小鼠体内分离的不同接合子,pRST98/E.coli菌株耐药性亦有不同,显示耐药质粒表达的多样性和复杂性。     

质粒介导重排子的发现、结构和功能

细菌耐药性已成为全球关注的重大公共卫生问题。接合转移是耐药质粒快速传播的重要方式,其中Ⅳ型菌毛在此过程中发挥着重要的作用。Ⅳ型菌毛具有黏附作用,能够使细菌黏附在宿主细胞和其他介质表面,帮助细菌形成生物被膜、细菌聚集体和微菌落,是细菌在液体中接合转移的重要因素。PilV蛋白是R64质粒Ⅳ型菌毛尖端黏附素,可以识别细菌细胞膜上的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)。重排子(shufflon)结构是多重DNA倒位系统,可使PilV蛋白多样化,进而影响细菌液体接合转移过程中的受体菌识别和接合转移频率。重排子结构最先发现存在于IncI1质粒R64,后陆续在IncI2、IncK、IncZ质粒以及伤寒沙门氏菌致病岛中被发现,其主要由A、B、C、D这4个片段及特异性重组位点sfx组成,受其下游重组酶基因rci的调控,不同质粒的重排子结构存在一定的差异。近期备受关注的可转移多黏菌素耐药基因mcr-1主要位于IncI2型质粒上,重排子可能是其快速传播的原因之一。本文综述了质粒介导重排子的发现、结构、功能和流行,期望基于对重排子更全面深入地了解,能够为耐药质粒的传播机制和控制策略研究提供...     

细菌抗药质粒中抗性基因的转座作用

ER275、ER396(Tc~r、Ap~r、Cm~r、Sm~r、Su~r)与DR233、DR416(Tc~r、Cm~r、Sm~r、Su~r)是来自临床的抗药质粒。当带有这些质粒的菌株分别与大肠杆菌J5-3/R144drd3(Km~r)配对时,组成了两种质粒共存的菌株。用这种质粒共存的菌株作为接合转移的给体,并以Ap或Sm作为选择药物,得到ApKm或SmSuKm抗性类型的转移接合子,此种转移接合子能将ApKm或SmSuKm抗性作为一个单位连锁地转移到受体菌株,而且转移频率与R144drd3相似。 生化的研究表明,ER275、ER396质粒中的Ap抗性基因编码β-内酰胺酶,DR233与DR416质粒中的Sm抗性基因编码链霉素钝化酶,而带有Ap Km或Sm Su Km重组质粒的转移接合子也分别具有了合成这二种酶的能力。因此我们推测在ER275、ER396与DR233、DR416质粒中分别有可转座的Ap抗性基因与可转座的SmSu抗性基因存在。