嗜热性乙醇发酵的研究进展

本文介绍了嗜热硫化氢梭菌,布氏嗜热厌氧细菌、乙醇嗜热厌氧杆菌,热纤梭菌等嗜热乙醇苗的生长特性以及嗜热性乙醇发酵过程中与终产物形成相关的酶学特性和代谢调控机理,最后讨论了几种提高乙醇产量的技术。     

胞内氧化还原水平对嗜热厌氧乙醇菌 发酵代谢的影响

辅酶NADH/NAD+在细胞内氧化还原反应中起着重要的作用,是细胞生长和能量代谢必不可少的辅因子。调节微生物胞内NADH/NAD+的比率是定向改变微生物代谢,高效获得目标代谢产物的有效手段。嗜热厌氧乙醇菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)是高温厌氧菌中乙醇产量较高的代表性菌株,本文利用不同氧化还原态的碳源改变T.ethanolicus的胞内NADH/NAD+含量和比例,进而研究了其对细胞生长、代谢产物分布的影响。以不同比例的葡萄糖/甘露醇作为混合碳源发酵,胞内氧化还原水平、细胞的生长特性、代谢产物都发生了不同程度的差异,以葡萄糖作为唯一碳源进行培养时,T.ethanolicus生长良好,乙醇产量为0.79g/L,但胞内NADH/NAD+比值和乙醇/乙酸的比值都比较低,分别为0.47和4.82;随着葡萄糖在混合碳源中比例的下降,NADH/NAD+比值增高,发酵产物中乙醇/乙酸比值也呈现上升的趋势。而以甘露醇作为唯一碳源时,发酵产物中乙醇浓度为0.389g/L,NADH/NAD+比值和乙醇/乙酸的比值分别为1.04和16.0。     

一株厌氧嗜盐菌的鉴定

从冬尖腌制品中分离到一株厌氧嗜盐菌（SEM）,该菌为革兰氏阴性杆菌,大小为0．5×6.0μm,专性厌氧,不运动,不形成芽孢,生长需要8％～25％NaC1,最适生长盐浓度为12．50～17．50,能利用多种糖和醇,发酵葡萄糖产生丙酸和已酸。它应归属于严格厌氧嗜盐菌Haloanaerobe,但与已报道的几个种有较大差异,是否为新种,还有待于进一步研究。     

嗜热厌氧杆菌X514生长及代谢的初步研究

嗜热厌氧杆菌X514(Thermoanaerobactersp.X514)是纤维素乙醇生产中最具潜力的菌株之一。对X514在3种培养基中的生长及代谢特征进行分析后发现,培养基1190比GS-Ⅱ和2473更适合运用于X514的代谢研究及乙醇发酵。其次,分别在1190培养基中添加不同浓度的酵母提取物和葡萄糖,对X514的生长及代谢作进一步研究。结果表明,在0.5-2 g/L范围内,酵母提取物浓度的增加有助于提高X514的生物量,乙醇等产物的产量及乙醇产率,说明酵母提取物对X514生长及乙醇发酵有促进作用;在2-10 g/L范围内,葡萄糖浓度的增加可提高乙醇等产物的产量而不会改变各产物的产率;糖消耗量并不随着初始底物浓度的增加而线性增长,而是在一定阶段趋于消耗最大值。反映了X514在底物充分的条件下,只有通过改进其他制约条件,才有可能提高底物的利用率及产物的产率。     

高温厌氧条件下纤维素的直接乙醇发酵

本文介绍了出分解纤维素的嗜热厌氧菌Clostridium celluloflavus sp.nov.直接发酵纤维素产乙醇的初步研究、发酵于60℃下进仃,其主要产物为乙醇、乙酸、氢气和二氧化碳。文中介绍了间歇发酵的若干特征与影响发酵的因素,1％纤维素发酵至120小时,大约有70％纤维素被分解;乙醇的转化率约为0.36g/g降解纤维素;发酵液中乙醇浓度达到56至61mM。发酵中乙醇与乙酸浓度的比值因发酵时间与其它发酵条件的不同而不同。     

响应面法优化嗜热链球菌AR333电转化条件

【背景】嗜热链球菌AR333是本实验室从发酵乳中筛选出的一株高产活性胞外多糖乳酸菌。【目的】建立嗜热链球菌AR333高效电转化体系。【方法】通过单因素试验和Box-Behnken响应面法优化电转化条件。【结果】嗜热链球菌AR333最优电转化条件为甘氨酸浓度8.3g/L,OD_(600)为0.8,10%甘油(体积比)和0.5 mol/L蔗糖的电转缓冲液,pIB184质粒80 ng,电场强度14 kV/cm,0.4 mol/L山梨醇、2 mmol/L CaCl_2和20 mmol/L MgCl_2的LM17复苏培养基,复苏时间5 h。【结论】在最优电转化条件下,嗜热链球菌AR333电转化效率达到3.68×10~5 CFU/μg-DNA,比优化前提高了14倍,实现了嗜热链球菌AR333的高效遗传转化,为其功能解析和基因工程改造奠定基础。     

嗜热厌氧乙醇杆菌α-葡萄糖苷酶基因的表达及酶学性质的研究

用PCR方法从嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)JW200中扩增出编码a-葡萄糖苷酶的基因,将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pTrc99A上并获得表达a-葡萄糖苷酶的大肠杆菌重组菌。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测出蛋白相对分子量约89kDa,经阴离子交换层析和凝胶层析纯化后的a-葡萄糖苷酶最适反应温度为70℃,最适反应pH为5～5.5,且在pH 5.5～6.5之间有较高的稳定性。重组a-葡萄糖苷酶在70℃下105 min后酶活仍达到80%。     

混合添加乙醇和H2O2对嗜热子囊菌产过氧化氢酶的影响

在以嗜热子囊菌( T. aurantiacus WSH03-01BC)生产过氧化氢酶的7L罐发酵研 究中,发现混合添加适量的乙醇(75%)和H2O2可以促进菌体产酶.在发酵36h和 48h分别添加0.8%(v/v)的乙醇时,酶活比对照提高了34.3%;当添加乙醇的总量超过2.4 %时 ,对菌体的生长及产酶有明显的抑制作用;在发酵36～60h恒速流加1.6%的乙醇,CAT的酶活 达到2519U/mL,单位细胞产酶能力提高了47.3%;在发酵36h～60h恒速流加1.6%的乙醇并在4 8h混合添加0.4%的H2O2时,CAT的酶活达到2786U/mL,比对照提高了50.1% .     

一株高乙醇耐受的嗜热细菌Anoxybacillus sp. WP06的性质研究

厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)的菌株WP06是一株兼性厌氧的嗜热细菌, 能利用木糖、阿拉伯糖和葡萄糖等产生乙醇。不像绝大多数嗜热细菌, WP06菌株在高温下表现出极高的乙醇耐受力, 60oC时在8%的乙醇胁迫下才出现生长抑制现象, 15%的乙醇胁迫下仍能生长, 是目前已知的乙醇耐受力最高的嗜热细菌。WP06菌株突破了人们对高温下细菌耐受乙醇浓度的极限认识, 是研究高温下乙醇耐受机制的良好出发菌株。     

一株高乙醇耐受的嗜热细菌Anoxybacillus sp. WP06的性质研究

厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)的菌株WP06是一株兼性厌氧的嗜热细菌, 能利用木糖、阿拉伯糖和葡萄糖等产生乙醇。不像绝大多数嗜热细菌, WP06菌株在高温下表现出极高的乙醇耐受力, 60oC时在8%的乙醇胁迫下才出现生长抑制现象, 15%的乙醇胁迫下仍能生长, 是目前已知的乙醇耐受力最高的嗜热细菌。WP06菌株突破了人们对高温下细菌耐受乙醇浓度的极限认识, 是研究高温下乙醇耐受机制的良好出发菌株。     

制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究

旨在建立一种高效大肠杆菌电转化感受态细胞的制备方法,研究了摇瓶装液量,菌体生长阶段,转化电场强度,转化后复苏时间以及感受态细胞存放时间等对转化效率的影响.结果表明,基液量为400 mL/2L,菌体在OD600值为0.452时收集所制备的感受态细胞,在电场强度12.5 kV/cm条件下电击5 ms,转化后复苏时间2h,转化效率可达到1010CFU/μg DNA.此条件下制备的感受态细胞转化效率高,质量稳定,重复性好.     

一株高效降解木糖的耐酸、嗜热厌氧杆菌的生理特性及产物分析

【目的】分离高效降解木糖的嗜热厌氧杆菌菌株,用于发酵生产生物燃料乙醇,为后继的构建基因工程菌株及联合生物工艺提供材料。【方法】运用亨盖特厌氧操作技术从胜利油田油层采出液两年的富集样中分离到一株嗜热厌氧杆菌xyl-d。采用形态学观察、生理生化指标鉴定及基于16S rRNA的系统发育学分析确定其分类地位。【结果】菌株xyl-d为革兰氏阴性厌氧杆菌,菌体大小为(1.35-5.08)μm×(0.27-0.40)μm,单生、成对或成簇生长,芽胞圆形,端生。温度生长范围30-85℃(最适温度65℃);pH范围3.0-10.0(最适pH 7.5);NaCl浓度范围0%-4%(最适NaCl浓度2.0%)。发酵D-木糖的产物是乙醇、乙酸、CO2及少量的异丁醇、丙酸。菌株xyl-d的(G+C)mol%含量为45.6%,与热厌氧杆菌属模式菌株威吉利热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter wiegelii)DSM10319T及嗜热乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)DSM2246T的16S rRNA序列相似性均为99.3%。菌株利用D-木糖产乙醇的最佳初始pH为8.5;少量酵母粉能刺激生长并显著提高发酵D-木糖的产醇率,使乙醇成为主要的发酵产物;培养基中乙醇浓度达到7%(V/V)时菌体生长受到抑制,最佳生长条件下D-木糖的降解率可达91.37%,最佳产醇条件下发酵1摩尔D-木糖可产生1.29摩尔的乙醇。【结论】菌株xyl-d是从特殊生境(油藏)中分离到的一株高效降解D-木糖的耐酸、嗜热的厌氧杆菌,其为半纤维素降解产乙醇的联合生物工艺提供了菌源。     

嗜热乙醇杆菌中醛/醇脱氢酶的双启动子分析

克隆了嗜热乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)中乙醇代谢的关键酶之一醛/醇脱氢酶(alcohol/acetaldehydedehy drogenase,AdhE)基因的上游假定启动子序列,并进行了结构分析。结果表明,adhE的上游序列是启动子,能启动报告基因在大肠杆菌中持续表达。首次发现adhE的启动子序列中存在两个独立的启动子(P172和P37)和核糖体结合位点(SD172和SD37),分别都具有完整功能,但其活性均低于完整的启动子序列。由此推测嗜热乙醇杆菌中adhE的表达受这两个启动子协同调控。     

嗜热厌氧乙醇杆菌调控因子PadhE-1的分离、重组表达及其与adhE基因启动子的结合

嗜热厌氧乙醇杆菌发酵是生产纤维素乙醇的有效途径,而嗜热厌氧乙醇杆菌醛/醇脱氢酶(AdhE)是其乙醇代谢途径中的关键酶。以adhE启动子区域的DNA序列(TRRadhE)作为诱饵,通过制备核酸亲和层析柱,利用调控因子与DNA特异性结合的特点,得到调控因子PadhE-1。经过蛋白测序和NCBI数据库的比对,发现其N端序列与Thermoanaerobacter pseudethanolicus39E的LacI家族转录调控因子(GenBank accession No.YP_001665770)有90%的同源性。根据同源性设计引物,从嗜热厌氧乙醇杆菌JW200基因组中通过PCR扩增得到调控因子PadhE-1的基因,并克隆到表达载体pET-28a得到重组质粒pET-PadhE。转化大肠杆菌JM109(DE3),经IPTG诱导表达,Ni2+亲和柱纯化,得到重组表达的调控因子PadhE-1。体外凝胶阻滞实验证实PadhE-1能与TRRadhE特异性结合。这将有助于我们了解嗜热厌氧乙醇杆菌的乙醇代谢调控机理。     

双歧杆菌感受态细胞的制备和电转化条件的研究

介绍目前常用的双歧杆菌感受态细胞制备方法,并系统研究影响双歧杆菌电转化效率的关键因素。通过研究,菌体在4oo为0.3-0. 5时收集以制备感受态细胞,制备好的感受态细胞应尽早用于电转化;最佳电场强度为12.5 kV/cm;转化后的细胞复苏培养2 h为佳。感受态细胞的转化效率可达103 CFU/μg DNA。     

产顺式-4-L-羟脯氨酸工程菌的构建及转化条件的优化

【目的】构建产顺式-4-L-羟脯氨酸(cis-4-Hyp)的工程菌并优化其转化条件。【方法】通过调整大肠杆菌的密码子偏好性以及mRNA二级结构对顺式-4-L-脯氨酸羟化酶(cis-P4H)基因进行优化,构建该基因的表达菌株。采用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化cis-P4H,测定cis-P4H的酶活和稳定性。然后采用全细胞催化法制备cis-4-Hyp,通过单因素试验和正交试验对相关的转化条件进行优化。【结果】构建了一株产cis-4-Hyp的工程菌,cis-P4H的比活为2.65 U/mg,半衰期为2.32 h。经过条件优化后,采用OD600为0.9时加入IPTG获得的工程菌菌体构建转化体系,在转化体系pH 6.5,转化温度为31°C,转化时间为60 h时,L-脯氨酸转化率最高达到83.33%。【结论】研究获得的工程菌及转化条件具有良好的工业应用前景。