壳聚糖固定化木聚糖酶的研究

从青霉菌m8提取出木聚糖酶,将其固定在用戊二醛交联的壳聚糖载体上。1．0g壳聚糖与4％的二醛结合固定3．5mg蛋白,酶活回收率为46．6％。在酶的最适pH为4．6,固定化酶为pH3．8。原酶的最适温度为55℃,固定化酶在60－75℃都具有较高活性。固定化酶的耐热性优于原酶,固定化酶的表现Km值略低于原酶,前者为5．0×10－2g／L,后者为3．58×10－2g／L。     

产纤维素酶菌株宇佐美曲霉Y-11产酶条件及酶性质的研究

通过正交试验,对宇佐美曲霉纤维素酶固态发酵条件进行了研究,其较适培养基为：麸皮与稻草配比为２：３,氮源：尿素,含水量：２００％（液固比）,ｐＨ：５．５。２８－３０℃培养７２小时,ＣＭＣ酶活力为５．０５（ｕ／ｍｌ）,滤纸酶活力达到１．０４（ｕ／ｍｌ）。ＣＭＣ酶及滤纸酶最适ｐＨ分别为４．４１、６．０６;最适温度分别为６５℃、５５℃。酶的热稳定性与ｐＨ稳定性较高。     

头孢菌素脱乙酰酶的重组表达及固定化

本文构建了利用trp启动子表达头孢菌素脱乙酰酶(CAH)的重组大肠杆菌DH5α-pCAH。重组菌在7L发酵罐(装液量2L)中发酵28 h,发酵液OD_(600)达到27,产酶313 kU/L发酵液,粗略估算重组蛋白占细胞总蛋白的70%。发酵生产的重组CAH粗酶液经过硫酸铵分级沉淀分离纯化和超滤除盐浓缩两步操作,纯化倍数为1.44,总酶活回收率56%,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化后蛋白没有明显杂蛋白条带出现。纯化后的CAH共价结合固定在环氧基载体LX-1000EP(c)上,通过对固定化条件的优化最终得到固定化酶比活443 U/g。该固定化酶重复催化50 mL 5%7-ACA底物100次后,酶活没有降低。     

海枣曲霉木聚糖酶的提纯和性质

通过硫酸铵分段、异丙醇分段、Sephadex G一100凝胶过滤、及DEAE-Sephadex A-50离子交换柱层析等提纯步骤,从海枣曲霉(Aspetgillu,phornicis)的麦麸培养物抽提液中分离到4个成份的木聚糖酶,分别称之为X一1、X—II、x—III和X—IV。 经7％凝胶浓度的圆盘电泳及薄层等电聚焦分析,x一1、X．IJ和x—Ill皆为均一成分,x—Iv中则仍杂有少量X~llIo X-I的最适pH为4．0,最适温度45℃,在pH 5．0--9．0之间稳定,保温30分钟时的半失话温度t为90℃。X一和x一 的最适 分别为{．及5．,最适温度均为,稳定pH范I 11 IlI pH 50 50~(3画分别为6．0—10．0及7．0--10．0,t1分别为60及55"C。SDS一凝肢电泳法测得x一’、x-r／和x—111的分子量分别为26,500、35。,500及22,000。薄层凝胶等电聚焦法测得三者的等电点分别为{．7、{．4和4．0。在所测定的化学试剂中,Ag’、Hg’’和Mn冲对这三个酶均有较强烈的抑制作用。sDS对x—I活力影响较小,对x_I】和x—Ill则有强烈的抑制作用。脲对X-1的抑制作用大,对X-II和X—Ill的抑制作用小。     

甲壳素脱乙酰酶的研究概况及展望

甲壳素脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA,E.C.3.5.1.41)是一种能催化脱去甲壳素分子中N-乙酰葡糖胺链上的乙酰基,使之变成壳聚糖的酶。而壳聚糖因其独特的性质被广泛应用于医药、食品、化工、化妆品等行业。对CDA的来源、分离纯化和酶学性质、结构和催化机制、基因的克隆表达及应用前景等方面的研究进行了综述,并分析出今后的主要研究方向应在CDA基因的克隆表达、CDA底物的改造及CDA的结构和催化机制等方面。     

不同脱乙酰度和分子量壳聚糖的神经亲和性研究

研究了四种不同脱乙酰度和分子量的壳聚糖与神经细胞的亲和性。利用酶联免疫技术（ELISA）测定了人血清白蛋白和纤粘蛋白在四种壳聚糖膜上的吸附量,并利用圆二色柱（CD）测定了人血清白蛋白吸附在四种壳矣糖膜上的二极结构。通过研究它们对胎鼠大脑皮层细胞（FMCC）生长的影响,发现在这四种壳聚糖中,分子量较大的两种壳聚糖更有利于神经细胞的生长,许多轴突聚集成树干状。     

枯草芽孢杆菌甲壳素脱乙酰酶的酶学性质

研究了甲壳素脱乙酰酶的热稳定性及酶的反应体系作用条件:酶(干重)添加量为40 mg.L-1,甲壳素底物(干重)质量浓度为75 mg.L-1,反应时间为90 m in,金属离子Mg2+对酶活有激活作用,在最适宜反应条件下的酶活为2250 U.L-1。甲壳素脱乙酰酶的酶解方式为外切酶型,酶降解终产物对酶活力有抑制作用,酶对甲壳素有一定的降解作用。     

甲壳素脱乙酰酶产生菌产酶条件的优化

采用斜面培养和液体发酵培养产甲壳素脱乙酰酶的真菌构巢曲霉,并且研究了产酶条件。结果表明,构巢曲霉的最适产酶条件为：发酵培养基初始pH值为6.5、发酵时间为96h、培养温度为31℃、碳源浓度为2%、氮源浓度为2%、金属离子浓度为0.01mol/L、接种量为6%。     

壳聚糖固定化琼脂酶的研究

采用壳聚糖微球对琼脂酶进行固定化,在单因素实验的基础上用正交试验法确定最佳固定化工艺。结果表明:在戊二醛体积分数为2.5%,交联时间为6 h,加酶量为15 mL,固定时间为3 h时固定酶的活力最高;固定化酶的最适反应温度及最适pH分别为50℃和8.5,高于游离酶;同时其热稳定性及操作稳定性均高于游离酶。     

枯草芽胞杆菌甲壳素脱乙酰酶的筛选及酶学性质*

从海洋泥土中分离出产甲壳素脱乙酰酶菌株,确定该菌株为产碱属芽孢杆菌,其产酶适宜培养条件为：pH4．0,添加金属离子Ca^2 ,培养时间为80h,温度为350℃。所得甲壳素脱乙酰酶作用的最适温度为40℃～50℃,最适pH为4．5-5．0之间。     

甲壳素/壳聚糖在酶固定化中的应用

作为功能性材料,甲壳素与壳聚糖分布广泛,且具有一系列独特的性质:无毒性、凝胶性、生物适应性、降解产物的无毒性、显著的蛋白质亲和性等。正是由于这些特性,虽然甲壳素/壳聚糖材料目前尚未得到充分的开发利用,但是与其它一些酶的固定化载体相比,具有广泛的开发前景。该文综述了近年来甲壳素/壳聚糖在酶的固定化方面的一些研究成果。主要包括:甲壳素/壳聚糖的理化性质、载体不同制备方法的特色和差异、在食品工业、非食品工业、环保、酶的分离纯化以及医疗应用方面的研究进展。     

硫色曲霉木聚糖酶基因xynA的克隆、表达及酶学性质分析

目的:分析硫色曲霉产木聚糖酶的酶学性质。方法:利用RT-PCR克隆了硫色曲霉的木聚糖酶基因xynA,构建了该基因的原核表达载体,并获得了诱导表达。结果:纯化的木聚糖酶的最适催化温度为50℃,最适反应pH值为2.4,在30～50℃保温30min对酶活性没有大的影响。结论:木聚糖酶在低pH值下的催化活性使之在饲料工业中具有较好的应用前景。     

Molecular Cloning,Overexpression, and Purification of a Major Xylanase from Aspergillus oryzae

The gene encoding xylanase G2 (xynG2) was isolated from a genomic library of Aspergillus oryzae KBN616, used for making shoyu koji. The structural part of xynG2 was found to be 767 bp. The nucleotide sequence of cDNA amplified by RT-PCR showed that the open reading frame of xynG2 was interrupted by a single intron which was 71 bp in size and encoded 232 amino acids. Direct N-terminal amino acid sequencing showed that the precursor of XynG2 had a signal peptide of 44 amino acids. The predicted amino acid sequence of XynG2 has strong similarity to other family 11 xylanases from fungi. The xynG2 gene was successfully overexpressed in A. oryzae and the overpexpressed XynG2 was purified. The molecular weight of XynG2 estimated on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis was 21,000. This was almost the same as the molecular weight of 20,047 calculated from the deduced amino acid sequence. The purified XynG2 showed an optimum activity at pH 6.0 and 58°C. It had a Km of 5.1 mg/ml and a Vmax of 123 μmol/min/mg when birch wood xylan was used as a substrate.     

硫色曲霉木聚糖酶基因xynA与xynB在大肠杆菌中的融合表达及酶学性质分析

根据硫色曲霉木聚糖酶基因xynA和xynB序列设计引物,PCR扩增获得574bp、594bp的目的基因片段.两段DNA分别用EcoRⅠ/BamHⅠ、BglⅡ/HindⅢ酶切后,连接到载体pET-28a( )的多克隆位点,构建了xynA和xynB融合表达载体pET-xynAB,即在木聚糖酶A和B之间引入了7个氨基酸的寡肽序列(GlyGlyGlySerGlyGlyGly).将pET-xynAB转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测到了一条约50ku的特异性表达条带.Ni-NTA柱纯化后的特异性蛋白经8mol/L脲素变性,梯度透析使蛋白质复性.酶学性质分析表明,该重组木聚糖酶的最适催化温度为50℃,最适pH值为4.4.在pH2.4～5.4范围内,酶的相对活性都在75%以上,重组酶在80℃保温30min还有近50%的残余酶活.不同种类的金属离子对重组酶的活力影响不同.     

壳聚糖固定化谷胱甘肽硫转移酶的研究

目的：利用壳聚糖固定日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶,并对固定化酶性质及体外催化活性进行研究。方法：利用大肠杆菌BL21(DE3)表达日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶,并从中粗提谷胱甘肽硫转移酶,将其固定在用戊二醛交联的壳聚糖载体上,对游离酶和固定酶的最适pH、温度,游离酶和固定化酶对底物1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)和谷胱甘肽(GSH)的亲和力,温度的稳定性进行了研究。结果：固定化酶活回收率可达41．6％,最适pH6．5～7．0,最适温度37℃,对底物(CDNB和GSH)的亲和力略有下降,对温度稳定性大大提高。在体外固定化酶有很好的催化解毒作用。     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因xynⅡ在不同毕赤酵母中的分泌表达

将宇佐美曲霉E001的内切-1,4-木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,得到重组质粒pPXY-NII,将其经SalⅠ线性化后分别转化2株毕赤酵母GS115和KM71,xynⅡ基因通过同源重组被整合到毕赤酵母染色体上,并处于酵母α因子的下游,经筛选获得阳性重组菌PXGL98(Mut+)和PXKL29(Muts)。该木聚糖酶基因在2株毕赤酵母中均实现了分泌表达。同时对工程菌的发酵条件进行了优化,在甲醇诱导下,PXGL98与PXKL29培养物上清液中的酶活力分别可达1156.92 U/mL和1646.03 U/mL。     

Catalytic properties of the immobilized Aspergillus tamarii xylanase

Xylanase from Aspergillus tamarii was covalently immobilized on Duolite A147 pretreated with the bifunctional agent glutaraldehyde. The bound enzyme retained 54.2% of the original specific activity exhibited by the free enzyme (120 U/mg protein). Compared to the free enzyme, the immobilized enzyme exhibited lower optimum pH, higher optimum reaction temperature, lower energy of activation, higher K_m (Michaelis constant), lower V_max (maximal reaction rate). The half-life for the free enzyme was 186.0, 93.0, and 50.0 min for 40, 50, and 60°C, respectively, whereas the immobilized form at the same temperatures had half-life of 320, 136, and 65 min. The deactivation rate constant at 60°C for the immobilized enzyme is about 6.0 × 10⁻³, which is lower than that of the free enzyme (7.77 × 10⁻³ min). The energy of thermal deactivation was 15.22 and 20.72 kcal/mol, respectively for the free and immobilized enzyme, confirming stabilization by immobilization. An external mass transfer resistance was identified with the immobilization carrier (Duolite A147). The effect of some metal ions on the activity of the free and immobilized xylanase has been investigated. The immobilized enzyme retained about 73.0% of the initial catalytic activity even after being used 8 cycles.     

米曲霉木聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建米曲霉木聚糖酶基因的真核表达载体,并转化巴斯德毕赤酵母,进行分泌表达。方法:以米曲霉总RNA为模板,根据已知的米曲霉木聚糖酶基因序列设计引物,采用RT-PCR技术克隆木聚糖酶基因cDNA序列,将其与pPIC9K质粒连接构建表达载体后转化毕赤酵母,经MM/MD快慢斑筛选,得到Muts型重组子,进行甲醇诱导表达。结果:克隆得到的cDNA序列全长666 bp,连续编码221个氨基酸;阳性克隆子在诱导培养数天后,将菌液点于RBB-木聚糖平板上,产生了明显的透明圈,表明重组木聚糖酶在毕赤酵母中获得表达。结论:木聚糖酶基因的真核表达载体构建成功,并能够在毕赤酵母中表达。     

链霉菌Strz-2胞外木聚糖酶的纯化和固定化研究

为探讨木聚糖酶被固定化后的酶活力变化 ,采用盐析、离子交换和分子筛层析方法对链霉菌胞外木聚糖酶进行了纯化 ,并采用DNS方法对固定化酶的性质进行了研究。结果如下 :粗酶液被纯化了 30 .5倍 ,比活力达 4 5 7.5 ,活力回收 4 2 .6 %。纯化后的酶固定在戊二醛交联的壳聚糖上 ,残活力为 4 1.8%。固定化酶的最适pH为 6 .0 ,最适温度为 5 5℃ ,且固定化酶在 6 5 -75℃活力都较高。该酶的耐热性比较强 ,固定化酶热稳定性优于原酶 ;以木聚糖为底物 ,固定化酶的表观米氏常数为 0 .83× 10 -2g/L。因此 ,固定化的木聚糖酶优于原酶