抗t-PA单克隆抗体的制备及初步应用

用猪心t-PA和人黑色素瘤细胞分泌的t-PA作抗原,经腹腔及脾内免疫Bal b/c小鼠。用细胞融合技术制备杂交瘤细胞,细胞融合串达85％,获得4株抗t-PA杂交瘤细胞株,鼠腹水抗体效价达1∶10~5;Western Blot结果表明该单抗所结合的抗原分子量与t-PA相符,证明所获得的单抗为特异的抗t-PA单抗;对t-PA的纤溶活性中和抑制试验结果表明,4株单抗中的1株能完全抑制st-PA的纤溶活性,另外3株表现出程度不等的抑制;其中1株亚类为IgG,另外3株为IgM。杂交瘤细胞株无支原体污染;染色体数目正常。对该抗体进行初步纯化后,将其应用于rt-PA的研究中。     

定量检测组织型纤溶酶原激活剂夹心ELISA方法的建立

目的:建立灵敏、特异的组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)定量测定方法,为血栓性疾病和肿瘤性疾病的早期诊断及疗效评估提供辅助手段。方法:采用抗t-PA多克隆抗体包被酶联板、HRP标记抗t-PA单克隆抗体为标记抗体、重组t-PA为标准品,建立定量测定t-PA的夹心ELISA双抗体法。以t-PA测定的特异性、灵敏性和重复性评价夹心ELISA测定法。结果:夹心ELISA测定法可检测t-PA浓度为0.5ng/mL的样品,不同样品的组内和组间的变异系数分别为4.7%和8.4%。采用夹心ELISA法测定40份正常人血浆,t-PA的平均含量为(4±2.1)ng/mL。结论:夹心ELISA测定法具有灵敏性高、特异性强的特点,可用于人血浆中t-PA水平的定量测定。     

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体工程细胞株生物学特性分析

t-PA突变体工程细胞株FSGGI48形态与其亲代细胞CHO-dhfr相似呈多角形,类似上皮细胞。在MTX加压至5×10~(-6)mol/L时,少数细胞形态略变瘦长,但仍呈多角形,因此该工程细胞株形态正常。抗体中和抑制试验及纤维蛋白板80℃加热试验显示,FSGGI48细胞表达产物与st-PA的活性均能被抗t-PA抗体所抑制,而胰酶的活性则不被抑制,且二者在80℃加热的纤维蛋白板上均不产生溶解圈,胰酶则产生溶解圈,由此可知,该细胞株表达产物为特异的rt-PA产品。细胞无血清培养上清经FA-PA检测,亚克隆株表达水平为4000IU/10~6细胞/24h。分别测定冻存3个月后复苏和体外传代3个月以上细胞的表达水平,结果显示部分亚克隆细胞株表达水平下降,多数仍为3000-4000IU/10~6细胞/24h,说明细胞株稳定性好。裸鼠试验表明,该工程株活细胞、细胞DNA、纯化的细胞表达产物均无致瘤性。支原体检查结果为阴性。染色体分析显示,FSGGI48细胞与其亲代细胞(CHO-dhfr细胞)染色体数目相同均为20条,但均有不同程度不同类型的畸变。CHO-dhfr细胞畸变率为6%。该工程细胞的畸变率为15%-18%,在允许范围内。结果证明,t-PA突变体细胞株FSGGI48为性能优良的工程细胞株。     

抗t-PA抗体水平和血栓的相关性研究

目的:研究自身免疫性疾病病人抗t-PA抗体水平和病人血栓形成之间的关系。方法:用酶联免疫吸附法(ELISA)检测原发性抗磷脂综合症和红斑狼疮患者(32例狼疮样抗凝物阳性,32例狼疮样抗凝物阴性)与40例健康对照的IgG类抗t-pA抗体的水平,用Pearson Chi-Square test的方法分析了病人体内IgG类抗t-PA抗体水平和血栓之间的相关性。结果:本试验研究的病人群体中IgG类抗t-PA抗体阳性的有13(20.3%)个,并且我们的研究表明IgG类抗t-PA抗体阳性和血栓病史显著相关(P=0.04)。结论:原发性抗磷脂综合症和红斑狼疮病人群体中有较高的IgG类抗t-PA抗体水平,它们可能和病人体内血栓的发生有关。     

限量抗原底物珠体系固相酶免疫分析法用于抗腺病毒的IgG抗体的检测

1978年冬至1979年春我们用固相酶免疫分析法中的限量抗原底物珠体系(Dass)间接法检测临床诊断为病毒性肺炎及麻疹合并病毒性肺炎患儿的9 l例双份血清中的抗3和7型腺病毒的0gG抗体,同时以微量血凝抑制试验进行对照,其符合率为90．5％。同时期对临床诊断为非腺病毒感染的lo例双份血清进行检测,两种方法滴度均无四倍升高。非腺病毒感染息者DAssIgG抗体水平较有近期感染患者为低,前者1：64,后者1：2,048。对抗3和7型腺病毒的兔免疫血清及正常兔血清Dass法测定结果及抑制与阻断实验均说明本方法是特异的,其灵敏度较血凝抑制试验高约50倍左右。     

t-PA突变体的构建、表达及生物学特性分析

t-PA是纤溶系统的生理性激活剂,但它在血浆中半衰期甚短及活性可被天然快速抑制剂PAI-1抑制等生理特性成为其作为临床溶栓剂的主要缺陷。为了研制新型t-PA溶栓剂,本文根据t-PA结构与功能研究的最新信息,针对延长t-PA半衰期、提高特异活性及引入PAI-1抗性等,设计并构建了8种t-PA突变体。进而在COS-7及CHO细胞中进行了表达研究,并对突变体表达产物的特性进行了分析和评价。     

唐氏综合症决定域蛋白1泛素化分析

利用Fm oc固相多肽合成的方法合成DSCR1羧基端一个多肽片段(55-70AA),经HPLC纯化后偶联到匙孔槭血蓝蛋白,免疫新西兰雄兔后采血检测、纯化、经W estern b lotting、免疫沉淀证实得到的抗体为抗DSCR1的特异抗体。该抗体即能检测人源DSCR1蛋白,又能检测小鼠的DSCR1蛋白。运用获得的DSCR1多克隆抗体进行功能研究,发现DSCR1广泛存在泛素化,参与泛素化-蛋白酶体途径。     

伤寒杆菌SOD抗体对小鼠腹腔吞噬细胞杀灭伤寒杆菌的影响

为了制备伤寒要直菌ＳＯＤ抗体,研究该抗体对小鼠腹腔吞噬细胞杀灭伤寒杆菌的影响,探讨ＳＯＤ与伤寒杆菌抗吞噬作用的关系。采用纯化的伤寒杆菌（Ｓｔｗｌ）Ｆｅ－ＳＯＤ免疫农兔制备兔抗Ｆｅ－ＳＯＤ抗体。利用ＥＡＬＩＳＡ法检测抗体的效价。免疫电泳、双向琼脂扩散试验和抗体对酶活性抑制试验分析抗体的特性。用不同浓度的抗体预先处理伤寒杆菌,然后进行小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬杀菌试验。试验结果抗体的ＥＬＩＳ攻疚价为１：１     

自身免疫性疾病患者抗2GP1抗体和抗t-PA抗体的相关性

目的:研究自身免疫性疾病患者抗2GP1抗体水平和抗t-PA抗体水平之间的关系。方法:用酶联免疫吸附法(ELISA)检测原发性抗磷脂综合症和红斑狼疮患者(32个狼疮样抗凝物阳性,32个狼疮样抗凝物阴性)与40例健康对照的IgG类抗2GP1和抗t-PA抗体的水平,用竞争ELISA的方法研究抗2GP1抗体与t-PA的互作。结果:64个病人中有8个IgG类抗2GP1和抗t-PA抗体共存,并且这两种抗体的共存和血栓病史显著相关(P=0.02)。我们还发现两个来自病人的抗2GP1抗体能和t-PA交叉互作。但是,在这些病人群体中未发现这两种抗体显著相关。结论:病人体内可能存在能和t-PA交叉互作的抗2GP1抗体。     

腮腺炎病毒抗血清的制备

以制备适用于疫苗生产检定中病毒鉴别试验和外源因子检查的高效价腮腺炎病毒抗血清为目的。用腮腺炎病毒接种SPF鸡胚尿囊腔,培养收取病毒尿液免疫SPF鸡,采集抗血清。腮腺炎病毒接种Vero细胞,培养病毒抗原经PEG沉淀,超速离心法纯化后免疫家兔采集抗血清。比较两种免疫方法所得病毒抗血清效价。结果显示SPF鸡抗腮腺炎病毒血清中和抗体GMT为1:1716,兔抗腮腺炎病毒血清中和抗体GMT为1:732。两种动物抗血清均适用于疫苗生产相关检定。免疫SPF鸡制备的病毒抗血清无特定病原及抗体污染,是毒种外源因子检测和疫苗鉴别试验的理想试剂。免疫SPF鸡制备病毒抗血清的程序简单,结果易于验证,有利于生物试剂标准化。     

组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）工程细胞系遗传特性及成瘤性分析

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)因其在防止血栓形成中起重要作用而受到人们的重视。但由于t-PA在血液中半衰期很短,作为溶栓药,一时难于推广。为了延长半衰期、增强其特异活性,本组构建了t-PA突变体并在CHO-dhfr~-细胞中获得了高效表达。我们在细胞培养基中加入秋水仙素,通过低张、固定、染色,进行染色体分析,结果表明,t-PA工程细胞系染色体条数为20条,畸变类型有异着丝粒。四倍体、裂隙、断片,畸变率为15％,属于正常范围。同时我们对该细胞系进行成瘤性试验,选用4周龄裸鼠作为试验鼠,以Hela细胞为阳性对照,CHO-dhfr~-细胞为阴性对照,试验表明:t-PA工程细胞及表达产物对裸鼠均无成瘤性。     

青杄FKBP12基因原核表达和多克隆抗体的制备

目的:制备青杄FKBP12基因的多克隆抗体,为进一步分析FKBP12的蛋白定位、表达等提供基础。方法:采用PCR方法扩增FKBP12基因得到其全长cDNA序列,并将其克隆至原核表达载体pET-48b中,转化入BL21菌株。经IPTG诱导,表达了分子量约为33kD的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。此蛋白经亲和纯化后,作为抗原注射新西兰兔,进行抗体制备。结果:成功获取了多克隆抗体,制备的FKBP12兔抗血清效价在1∶729 000以上,ELISA结果表明融合蛋白具良好的免疫原性。间接ELISA法检测纯化后抗体效价,表明纯化后抗FKBP蛋白兔多克隆抗体效价高,检测灵敏度为16ng/mL。结论:所制备的抗体能满足后续试验要求的效价值,为进一步研究提供基础。     

一种抗AIV共有独特型抗体具有AIV血凝素分子的内影象

用纯化的鸡抗禽流感病毒(AIV)IgG作免疫原,通过单克隆抗体技术制备出1株分泌针对鸡抗AIV和兔抗AIV共有独特型抗体的杂交瘤细胞.竞争抑制试验、特异性检验和诱导产生血凝抑制抗体的功能实验证明,此抗体具有AIV血凝素分子的内影象.     

一种抗AIV共有独特型抗体具有AIV血凝素分子的内影象

用纯化的鸡抗禽流感病毒(AIV)IgG作免疫原,通过单克隆抗体技术制备出1株分泌针对鸡抗AIV和兔抗AIV共有独特型抗体的杂交瘤细胞。竞争抑制试验、特异性检验和诱导产生血凝抑制抗体的功能实验证明,此抗体具有AIV血凝素分子的内影象。     

狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸的制备

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的狂犬病病毒抗体检测方法,对犬等动物免疫狂犬病疫苗后的抗体水平监测提供参考。用醋酸锌沉淀法沉淀狂犬病病毒CVS11,Sepharose 4FF进行层析纯化。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金,标记纯化的狂犬病病毒,喷于试纸的结合释放垫 (金标垫),将SPA (葡萄球菌表面A蛋白) 和纯化的兔抗狂犬病病毒IgG分别喷于试纸的T (检测线) 处和C (对照线) 处,组装试纸条。用制备的试纸条对261份犬血清进行检测,与快速荧光灶抑制试验 (RFFIT) 检测的结果一致;对已知效价的犬狂犬病毒中和抗体 (VNA) 大于0.5 IU,结果为阳性;对狂犬病病毒中和抗体 (VNA) 小于0.5 IU/mL的血清,结果为阴性。制备的狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸检测犬血清抗体,具有特异、便捷、快速的特点,能够检测出狂犬病病毒中和抗体大于0.5 IU的血清,适用于临床犬血清抗体水平监测,具有良好的应用前景。     

MAP法制备抗人Connexin31抗体

MAP（multiple antigenic peptide）多肽法具有快速、简便、成本低廉的特点．用MAP法,直接在多肽合成仪上合成Connexin31羧基端一个多肽片段（250—266AA）的MAP肽,经超滤器纯化后,免疫新西兰雄兔后采血检测、并纯化．经western blotting、细胞免疫荧光染色、免疫沉淀证实得到的抗体为抗间隙连接蛋白31的特异抗体．     

SARS灭活病毒免疫兔后IgG特异抗体应答

将灭活的SARS冠状病毒抗原每隔两周多点注射免疫兔,共免疫3次,以观察SARS灭活病毒免疫兔后兔血清中IgG特异性抗体的应答变化。免疫前及第一次免疫后第8、14、21、28、35天耳静脉取血,分离血清。间接ELISA法测得血清中特异性IgG抗体持续升高,并表现出一定的剂量依赖性：第35天G1、G2、G3组血清IgG抗体滴度分别为1：51200、1：49600、1：25600;中和试验测得G1组第28天血清样品中和抗体效价为1：2560;蛋白芯片测得M、N、3CI,、S1、S2、S3、S4等病毒蛋白抗原都可特异性结合抗血清中的IgG抗体,但是不同蛋白抗原结合能力有差别。因此可认为SARS灭活病毒经皮下注射免疫兔后,可诱导全身性IgG抗体应答,产生SARS冠状病毒特异性抗体。     

t-PA蛋白质分子的改造

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)与纤维蛋白有高亲和力,具有特异地溶解血栓的功能。t-PA含有多个结构域,其分子结构和功能关系的阐明,促进了改造t-PA分子以发展更特异的血栓溶解剂的研究。     

有关检测雌激素、孕激素、雌激素受体和孕激素受体水平的技术性探讨

应用兔抗雌二醇抗体、兔抗孕酮抗体,鼠抗雌激素受体和鼠抗孕激素受体抗体来检测乳腺癌等病例,结果显示,兔抗雌二醇抗体和兔抗孕酮抗体所标记的病例的阳性物主要见于癌细胞胞浆,应用石蜡切片且不经任何方法处理的结果为最好。应用鼠抗雌激素受体抗体和鼠抗孕激素受体抗体和鼠抗孕激素受体抗体的病例,阳性物见于癌细胞的胞核上,但需要用隔水热抗原修复法经较长时间的处理后,方能获得最佳结果。     

抗Ⅰ型马立克氏病毒sorf2蛋白的多克隆抗体制备及其特异性鉴定

[目的]制备高效价鼠和兔抗Ⅰ型马立克氏病毒(Marek's disease virus,MDV) sorf2蛋白的多克隆抗体并对其特异性进行鉴定.[方法]以Ⅰ型MDV GX0101为模板,利用PCR扩增sorf2基因,分别克隆进原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21 (Rosetta),经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导后进行融合蛋白的表达和纯化.用纯化的融合目的蛋白常规免疫6-8周龄Balb/c小鼠和成年新西兰大白兔,制备抗sorf2蛋白的多克隆抗体.用Western blot和间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性.[结果]Ⅰ型MDV的sorf2基因在原核表达载体中能够正确表达,免疫小鼠和兔后能获得与sorf2蛋白发生特异性反应的高效价的多克隆抗体.[结论]制备的抗sorf2蛋白的多克隆抗体能够特异的鉴定MDV sorf2基因缺失株,有效的区分MDV疫苗株HVT(FC-126)与Ⅰ型MDV毒株,用于临床MDV野毒的分离鉴定.