基因工程

核酸及蛋白质合成、提取、纯化931888ONA侧序反应纯化的固相方法〔英〕/Tong,X.…/Anal。Chem一1992,6魂(22)。一2672~2677〔译自DBA,1993,12(i),。3一00002〕 在酶促延伸反应中采用了5尸末端用吕:P标记、中间位置含生物素类的引物寡核昔酸,形成的产物与抗生蛋白链菌素包被的磁性珠拉结合。通过变性并洗涤珠粒除去模板链和其它反应污染物,通过在EDTA/甲酞胺混和物中加热,洗脱残留的纯单链片段。将珠粒固定于具固定磁铁的样品管之后,洗涤珠粒以除去各种污染物(如蛋白、盐类、模板DNA及未掺入或降解的三礴酸脱氧和双脱氧核昔。通过在9…     

核酸及蛋白质合成、提取、纯化

92弓1 38合成无dc-dG拖尾的全长双链cONA转录本的新方法〔英〕/Fukuoka,5.1.…了Nueleie AeidsRes一1991,19(24)一6961~6962〔译自DBA,1992,11(6),92一02479〕 该方法利用末端转移酶将dC同聚物拖尾(15个碱基)添加到eDNA中。用合成的01190一ribo一G (rG,巧聚体)引导全长第二条链cDNA的合成。完成ds cDNA合成后,用RNA酶H消除RNA-DNA异源双链核酸分子拖尾中的rG核昔酸,用噬菌体T4 DNA聚合酶消除暴露的单链dC同聚物拖尾。产生的ds oDNA转录本不含C/G拖尾,通过连接物一接头辅助消化可将其插人任一载体。(朱遐)923139DNA片段的…     

DNA聚合酶Ⅰ

1957年科恩伯格(A.Kornbeng)通过测定放射性标记的[~(14)C]胸苷三磷酸参入DNA的能力,发现一种催化DNA合成的酶。这种酶现在叫做DNA聚合酶Ⅰ或Pol Ⅰ,为含有928个氨基酸残基的多肽单链。酶促反应的底物是4种脱氧核苷三磷酸。反应需要DNA模板和一小段与模板互补的多核苷酸引物。反应中,引物或生长中DNA链的3′羟基与新参入核苷酸的α-磷酸基结合。反应     

基因标记、转化、表达与检测

920468采用生物素和一种荧光染料标记的引物对聚合酶链反应产物进行定t分析〔英万Landgraf,A.“·/A rtal.Bioehem。一1991,193(2)一231~235〔译自DBA,1991,10(12),91一06628〕 经生物素和异硫氰酸荧光素共价标记的PCR引物可被固定化分离。采用在5‘末端有不同标记的成对引物,可对PCR产物进行同步纯化和鉴定。产物经生物素标记,可用连有抗生物素蛋白或共类似物的吸附剂加以分离。对异硫氰酸荧光素标记的DNA引物进行碱变性和洗脱,即可定量测定荧光标记的吸人量。为测试实用性,用2个互补于人bcr外显子n的104bp靶序列的寡聚核普酸引物,…     

动物遗传工程

923441利用PCR快速而生物学安全性地诊断非洲猪疽病毒〔英〕/Steiger,Y.…了J.Clin。Mierobiol。-1992,30(1)一i~s[译自DBA,1992,11 (5),92一02463〕 部分定序了非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组保守区的740bp片段,设计并合成了4个PCR引物和1个寡核节酸DNA探针。利用寡核昔酸1和6为DNA引物、并利用来白下述样品的模板扩增了专性64obp PCR产物:受ASFV侵染的猪的器官和血浆;ASFV侵染的细胞培养物,含与原74obp克隆相同保守区的克隆的DNtA片段。对照无特殊反应产物。通过用巢状引物二次扩增或与专性生物素化寡核昔酸探针杂交确定PCR产…     

DNA分析与扩增

920044班射起动共振离子光谱法在ONA测序中的潜在应用[英〕/Arlinghaus,H.F.…尹Anal.Chem。一1991,63(5)一402~407〔译自DBA,1991,10(9),91一04828〕 采用溅射起动共振离子光谱(SIRIS)来检测亚原子摩尔量,经富含同位素的铁、锡标记的DNA,分辨率极好。合成了叛酸二茂铁和(三乙基甲锡烷基)一烷基数酸,并通过5‘己胺的一个氨基连接到寡核二阵酸的末端位置上。调整SIRIS方法,用来检测50pMol连于DNA上的Fe或Sn。在SIRIS中若用高重复率激光,而其它准备步骤不是限制因素,每天可能检测1千万个碱基。在聚丙烯酞胺和尼龙膜上分析铁、锡…     

DNA分析与扩增

JJ,‘翻920422大片段定位缺失:缝合环聚合酶链反应〔英〕/5 ong,C.…/B ioteeh Forum Enr一1991,s(s)一130一132仁译自DBA,2991,10(12),91-06633〕 用缝合环聚合酶链式反应(PCPCR)在载体中的噬菌体T7启动子与菊花矮小类病毒(CSV)的cDNA序列之间制造缺失,这样,不含外源序列的CSV RNA即可通过T7的离体转录来合成。新方法应用超螺旋质粒pBCSU172作为PCR扩增模板,产生不含要删除区的线性DNA分子。采用与线性分子两端相配对的第三寡核昔酸来制备缝合环状DNA,并用于大肠、杆菌JM109的直接转化。用该法合成了与天然CSV序列一样…     

一种DNA扩增的新技术： 利用热稳定的Bst DNA聚合酶驱动跨越式滚环等温扩增反应

Bst DNA聚合酶具有热稳定性、链置换活性及聚合酶活性,在体外DNA等温扩增反应中起重要作用. 本文利用Bst DNA聚合酶的5′→3′聚合酶、核苷酸（末端）转移酶及链置换酶活性发展了一种新的体外环式DNA扩增技术跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA)．在SRCA反应中,Bst DNA聚合酶以上游引物P1为模板合成其互补链RcP1,并和P1形成双链DNA|之后,Bst DNA聚合酶用其核苷酸转移酶活性在其P1的3′末端沿5′→3′方向随机掺入脱氧核糖核苷酸聚合形成寡聚核苷酸（dNMP)m序列,即DNA的合成反应跨越了RcP1 与下游引物P2之间的缺口|然后,以下游引物P2为模板形成互补序列（RcP2）;接着,Bst DNA聚合酶继续将脱氧核糖核苷酸随机添加到RcP2的3′末端,形成（dNMP)n序列．继而,Bst DNA聚合酶以RcP1为模板,继续催化聚合反应合成互补新链,并通过其链置换酶活性替换P1|如此往复,形成［P1-(dNMP)m-RcP2-(dNMP)n …］序列．本文通过电泳、酶切、测序等方法对扩增产物进行分析,演绎出上述扩增过程,并就工作原理进行了讨论．该反应可能对开发等温扩增技术检测微生物有一定助益,也为解释环介导等温扩增技术中假阳性反应和滚环等温扩增反应中的背景信号提供了线索．     

基因工程

852171 DNA片段链的分开及其从非变性聚丙烯酞胺凝胶中的分离〔英〕/James,R.…了Anal.Bioehem一1954,140(2)一456一458〔译自DBA,1984,3(21),84一09915〕 报道利用尿素和温和加热快速而定量地变性双链DNA(d sDNA)的一个技术。利用DNA聚合酶和适当的““PdNTP,通过填充反应将带有5产延长末端的DNA片段的3/末端加以标记,没结合的标记混合物通过SephadexG一50柱并用SDS一EDTA洗脱除去。标记的dSDNA加入固体尿素,65℃保温3分钟,接着在上聚丙烯酸胺凝胶前快速冷却变性。变性的互补DNA链在丙烯酞胺与双丙烯酸胺比率为60,1的非变…     

DNA分析与扩增

921624通过随机扩增多态ONA试验快速鉴定小球腔菌属的遗传变异和病变型〔英〕/G。。dwin,P.H.一,Appl.Environ.Mierobiol一1991,57(9)一2452~2456〔译自DBA,1991,10(22),91-13022〕 利用随机扩增多态DNA试验(RAPD)法鉴定T小球腔菌属Le尹亡05尹haer￡a“ac“忍a:s病变型及其遗传变异。通过随机十聚体 DNA引物进行聚合酶链反应扩增基因组DNA中的各种DNA型,鉴定出3组分离物。产生的多态现象为构建遗传图谱、进行DNA指纹鉴定提供了一便利途径。分离物1组含有毒病变型的所有分离物,2组含加拿大西部无毒病变型分离物,3组含安大略省…     

末端脱氧核苷酸转移酶在生物传感及核酸合成领域的应用*

末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)是聚合酶X家族中的一员,与典型的DNA聚合酶不同,TdT以恒温的无模板依赖的方式催化脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)聚合到寡核苷酸的3'羟基端来合成DNA。并且TdT对底物的耐受性高具有聚合修饰型dNTP的能力,如荧光修饰的dNTP、生物素修饰的dNTP,甚至人工碱基均可作为其良好底物。TdT的这些生化特性使其被广泛的应用在生物传感和核酸合成领域中,促进了许多基于核酸的工具和方法的发展,并为酶促从头合成DNA技术的发展奠定基础。介绍了TdT的性质,重点总结了它在其介导的生物检测技术、核酸的修饰技术以及酶促合成DNA技术三个方面的核心作用、目前面临的挑战以及未来研究的方向,以期促进TdT在生物传感器和核酸合成中的进一步应用。     

基因标记、转化、表达与检测

再于72℃下放置2.5分钟;用2种BLB引物对共扩增时,94℃1分钟(第一次循环3.5粉爹钟),在65922074利用pCR检测牛淋巴瘤中的牛白血病病那〔英〕/Rasmussen,H.B.…了Bioteeh。ForumEur一2991,s(9)一527~519〔译自DBA,1901,10(23),91一13308〕 利用聚合酶链反应(PCR)从含30只雌牛淋巴瘤样品的材料中将由牛白血病病毒(BLV)引起的肿瘤与其它病因的肿瘤区分开。设计了两种扩增DNA BLV一专性片段的引物对,还设计了第三种识别牛K一酪蛋白基因启动子区的引物对,以控制模板的质量。利用Taq DNA一聚合酶扩增DNA(0 .25件g),条件如下:用1种BLV…     

RNA的生物合成与加工(一)

所有细胞的RNA都是按照DNA模板的指令,由RNA聚合酶催化合成的。RNA的生物合成(转录)过程的有些地方与DNA复制相似,如底物是核苷三磷酸,合成方向是5′→3′。但,RNA聚合酶不需要引物,也不具备有校正作用的核酸外切酶活力。DNA模板在RNA合成中是全保留的,而在DNA复制中则是半保留的。原核生物的转录原核生物转录的源料主要是从大肠杆菌取得的。大肠杆菌的所有RNA都是由同一种RNA聚合酶催化合成的。这种酶的分子量为460KDa,全酶的亚基组成为α_2ββ′σ,核心酶为α_2ββ′。σ亚基只在转录的启动中起作用,     

核酸及蛋白质合成、提取、纯化

931129由各种方法纯化的质粒ONA的Taq循环翻序〔英〕/Hradetzky,D.…1 Bioteeh Forum Eur一1092,9(7~8)一471~472〔译自DBA,1992,11(20),92一11144) DNA模板的纯化是测序中最关键最困难的一步。就DNA得率、花费、碱基范围和碱墓精确率等方面,考察了制备双链DNA的各种方法,包括小型制备一水煮法,小型制备一碱法,氮化艳制备法,Stratagene过柱法,Qiagen过柱法。采用质粒pBlueseript IIKS、ABI Taq引物循环侧序药盒及AIB Taq染料脱氧终止子循环测序药盒,对DNA进行自动测序。Stratagene或Q二age。层析给出高纯度DNA,使测序范围…     

植物遗传工程

940738小南瓜花叶病毒外壳蛋白基因:克隆序列分析及其在烟草原生质体中1的表达〔英万Hu,J.S…了Areh.Virol一。1993,130(i一2)一17~31仁译白DBA,1993,12(19),93一11036〕 克隆了南瓜花叶就豆花叶病毒(SqMV)香瓜株系中间部分RNA的互补DNA。分离出SqMVmRNA,通过蔗糖梯度离心分级分离双链cDNA、用E。。Rl DNA一甲基化酶使之甲基化并将EcoRI-亲和性接头连到两侧末端。用EcoRI消化后,将。DNA克隆到质粒pUC18的EcoRI位点上。转化并筛选大肠杆菌DHS感受态细胞。设计了4种寡核普酸引物,用以在SqMV寡核昔酸序列和预测的多聚蛋白…     

友菌素核苷转移酶amiE基因的克隆、表达和功能鉴定

【目的】克隆和表达二糖核苷类抗生素友菌素生物合成基因簇中的核苷转移酶基因amiE,并研究AmiE的体外催化功能。【方法】采用PCR技术将编码257个氨基酸的葡萄糖-1-磷酸核苷转移酶基因amiE克隆到表达载体pET28a上,构建质粒pCSG4001,转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达;利用亲和层析分离纯化蛋白AmiE,以葡萄糖-1-磷酸和胸腺嘧啶三磷酸(TTP)或尿嘧啶三磷酸(UTP)为底物,利用高效液相检测AmiE的体外酶活;以甘露糖-1-磷酸、半乳糖胺-1-磷酸和半乳糖-1-磷酸和TTP作为底物,进一步研究AmiE对底物的选择性。【结果】N-末端融合组氨酸标签的AmiE蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,通过亲和层析纯化出的AmiE能够以TTP(或UTP)和葡萄糖-1-磷酸作为底物,催化形成胸腺嘧啶二磷酸葡萄糖(TDP-glucose)或者尿嘧啶二磷酸葡萄糖(UDP-glucose),但对其他三种底物,无明显催化活性。【结论】大肠杆菌中表达纯化的核苷转移酶AmiE能够体外催化形成TDP-葡萄糖(或UDP-葡萄糖),确证了AmiE作为核苷转移酶的催化功能,同时表明AmiE对底物具有一定的选择性。     

细菌基因在哺乳动物细胞中的表达

纯系繁殖的编码黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的大肠杆菌(E.coli)基因,同一系列的由SV40DNA衍生的不同载体构成重组体DNA。用这样的重组体DNA转染培养的猴肾细胞,结果产生的转化体能合成大量的易于测定的大肠杆菌黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶。而且,把这种细菌基因引进到嘌呤核苷酸合成特性缺陷的人莱许—奈恩(Lesch-Nyhan)细胞,这些细胞的此种生理缺陷便得到了纠正。     

DNA引发酶及其在肿瘤增殖和治疗中的作用

DNA聚合酶不能从游离的核苷酸开始合成DNA链,由DNA引发酶合成约7～10个核苷酸的RNA引物．DNA聚合酶利用引物提供自由的3′-OH末端合成新的DNA链。DNA引发酶在DNA复制的起始中起重要作用,而DNA复制是肿瘤细胞增殖的关键,抑制DNA引发酶活性,使引物的合成或延长受阻．DNA复制受抑制,肿瘤细胞不能增殖,从而达到抗肿瘤的目的。因此DNA引发酶是抗肿瘤药物研究的一个理想靶点。     

细菌基因在哺乳动物细胞中的表达

纯系繁殖的编码黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的大肠杆菌(E.coli)基因,同一系列的由SV40DNA衍生的不同载体构成重组体DNA。用这样的重组体DNA转染培养的猴肾细胞,结果产生的转化体能合成大量的易于测定的大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶。而且,把这种细菌基因引进到嘌呤核苷酸合成特性缺陷的人莱许-奈恩(Lesch-Nyhan)细胞,这些细胞的此种生理缺陷便得到了纠正。