疣粒野生稻金属硫蛋白基因的获得及序列分析

对SMARTTM技术构建的疣粒野生稻叶片cDNA文库克隆进行随机测序,获得了疣粒野生稻金属硫蛋白基因的cDNA序列.该序列全长412 bp,开放阅读框长186 bp,编码62个氨基酸,10个半胱氨酸集中分布在肽链的N端和C端,该蛋白的分子量为6.4 kD,理论等电点(pI)为5.14.Blastp同源性分析表明其属于金属硫蛋白基因家族.     

条锈菌诱导的小麦抗病与感病近等基因系SSH文库构建及分析

为分析条锈菌诱导下的小麦抗病与感病近等基因系之间差异表达的基因,以接种小麦条锈菌CY26小种的抗病近等基因系Yr4/6×Taichung 29幼苗叶片cDNA作为实验方,接种CY26的感病亲本Taichung 29幼苗叶片cDNA为驱动方,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建了一个包含1 300余克隆的消减文库。对文库中600个克隆进行了反向Northern点杂交筛选,对获得的阳性克隆进一步进行了Northern杂交验证,获得显著差异的克隆12个。经测序和BlastX分析,其中6个差异表达序列的推测产物分别为亮氨酸重复序列蛋白、过氧化氢酶、硫氧还蛋白、RNA结合蛋白、抗坏血酸过氧化物酶和热激蛋白。除亮氨酸重复序列为信号传导类蛋白外、其他几个均为抗病防御类蛋白。     

白叶枯病菌胁迫下云南普通野生稻SSH文库的构建及抗病相关基因分析

以云南普通野生稻为材料,利用抑制差减杂交技术（SSH）,构建了白叶枯病菌胁迫的云南普通野生稻特异表达基因的差减文库.通过对文库所有阳性单克隆进行测序,聚类分析后共获得494条高质量的表达序列标签（EST）.经过BlastN分析,有417条与已知功能的序列有较高同源性;经BlastX分析,有104条EST与未知功能蛋白或假定蛋白有较高相似性,49条EST未能找到同源匹配,341条EST与已知功能蛋白有较高同源性.初步分析发现,这些基因主要涉及能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、防御与抗逆应答反应、信号转导、光合作用及膜运输等代谢过程.使用半定量RT-PCR研究了7个可能与白叶枯病抗性相关的EST序列在云南普通野生稻对照和白叶枯病菌处理的叶片中的表达情况,并获得这些基因的表达谱.结果发现,克隆编号为OR7,OR68和OR826的EST受白叶枯病菌胁迫诱导上调表达,其中OR826 EST在蛋白数据库中无同源序列,可能是一类新的白叶枯病抗性基因,而组成型表达的OR143 EST在对照和接菌处理的叶片中均能检测到其mRNA的表达,但其表达量在白叶枯病菌胁迫48 h后逐渐增强,推测这些基因直接参与了云南普通野生稻抗病防御反应.本研究为从云南普通野生稻中发掘和克隆新的白叶枯病抗性基因提供了理论依据,为进一步研究云南普通野生稻抗白叶枯病的分子机制奠定了基础.     

云南疣粒野生稻稻瘟病抗性

野生稻(Oryza rufipogo)保存有许多栽培稻(O. sativa)不具备或已经消失的优异基因资源, 是扩大栽培稻遗传背景、改良产量与品质、提高抗病虫害及抗逆境能力的重要基因库。疣粒野生稻(O. meyeriana)是中国3种野生稻资源之一, 主要分布在云南。为进一步了解其稻瘟病抗性, 首先利用来自不同稻作区的稻瘟病菌株, 通过注射接种法对疣粒野生稻进行系统的稻瘟病抗性鉴定, 发现疣粒野生稻对接种的所有稻瘟病菌株都感病。进一步采用3'/5' RACE方法, 从疣粒野生稻中克隆了水稻同源基因Pid2和Pid3, 并构建过表达转基因株系对基因功能进行了研究。结果表明, Pid2和Pid3与疣粒野生稻中同源基因间在DNA和氨基酸水平上有较大的序列差异, 过表达转基因的日本晴植株对稻瘟病菌的敏感性与对照相似。推测疣粒野生稻在自然接种条件下, 表现出的抗稻瘟病表型很可能是其旱生叶片结构特征形成了对稻瘟病菌侵染的天然屏障。对控制疣粒野生稻这一类性状基因资源的挖掘和利用, 有利于优良抗性水稻品种的培育。研究结果为疣粒野生稻的研究利用提供了新信息和新思路。     

疣粒野生稻胚性细胞与叶片抗白叶枯病信号物质和相关抗病基因的表达差异

为了研究白叶枯病菌对疣粒野生稻的抗病信号物质和抗病基因的影响,将疣粒野生稻的胚性细胞(即愈伤组织,非特异化)和叶片细胞(已特异化)进行白叶枯病原菌胁迫处理,然后分别检测其抗病信号物质及抗白叶枯病相关基因的表达情况。结果发现,愈伤组织的SA和JA含量无论是未处理还是处理后均高于叶片细胞,这可能与愈伤组织没有特异化、细胞壁较薄致使病原菌易侵入有关,为了防止病原菌的侵害而产生高的表达量,同时说明疣粒野生稻抗白叶枯病能力是在原胚细胞就已具备;ME207基因在疣粒野生稻细胞特异化前后均有表达,而ME281基因则在细胞特异化前是诱导型表达基因、特异化后是组成型表达基因。     

通过cDNA微阵列鉴定水稻(Oryza sativa L.) 盐胁迫应答基因

利用水稻耐盐品种兰胜构建了一个高质量的cDNA文库以鉴定水稻盐胁迫应答基因, 从cDNA文库中提取约15000个质粒, 并用Biomek 2000 高密度点阵系统或手工操作, 将这些质粒点于尼龙膜上. 通过这种方法鉴定了30个盐应答基因, 对其中的12个基因通过Northern杂交进行表达分析, 确证了cDNA微阵列的杂交结果. 30个基因中, 18个基因受盐诱导, 另外12个基因受盐抑制, 其中27个在GenBank数据库中有同源序列. 根据功能, 这些基因大致可以分为5类：光合作用相关基因、物质运输相关基因、代谢相关基因、耐逆相关基因以及其他未分类的基因. 研究结果表明, 盐胁迫影响了植物生长发育的多个方面, 其中有些基因可能在植物体的耐盐过程中具有重要作用.     

从植物共生菌宏基因组文库筛选新的生物催化酶基因

【目的】通过建立宏基因组文库的高通量保存与基于探针洗脱的多次膜杂交筛选方法,从植物共生菌宏基因组文库筛选具有生物催化潜力的新酶基因。【方法】首先根据滴度将初始文库噬菌体包装颗粒感染到EPI300-T1R E.coli,过夜培养后对应保存于96孔板;提取粘粒进行文库的杂交筛选。【结果】描述的洗脱条件可完全去除尼龙膜上与靶DNA结合的探针,并且尼龙膜上的靶DNA至少可用于7次探针杂交,从而明显提高宏基因组文库的筛选效率。【结论】以Enoate reductase(ER)和短链脱氢酶(SDR)的同源基因片段为探针,运用该方法经两轮筛选获得候选单克隆并进行了部分粘粒的测序,发现了新的ER和SDR同源基因,并克隆到相应的全长基因序列用于后续的表达与酶化学研究。     

镰刀菌诱导的泸定百合SSH文库构建及抗病相关基因筛选

该研究以泸定百合(Lilium sargentiae Wilson)为材料,构建其组培苗经百合尖孢镰刀菌侵染后的叶片SSH文库,从中筛选镰刀菌枯萎病抗病相关基因。从正向SSH文库中随机挑取300个单克隆测序后得到280条ESTs,进行功能比对分析后,除去未知功能、沉冗蛋白以及无同源序列,得到有功能的ESTs共168条,其功能涉及信号传导、蛋白质合成与代谢、抗病与防御、物质与能量代谢、转录相关等多种途径,其中有31条ESTs与抗病防御相关。从抗病防御相关基因中选取8条ESTs:过氧化氢酶、ATP结合盒转运蛋白(ABC transporter)、Kunitz型胰蛋白酶抑制剂4(Kunitz trypsin inhibitor 4)、丝氨酸乙醛酸氨基转移酶、多聚泛素、脂氧合酶I(Lipoxygenase I)、丝氨酸/苏安酸蛋白激酶(Serine/Threonine-protein kinase)、抗坏血酸过氧化物酶(Arabidopsis thaliana),通过RTPCR对其表达情况进行分析,发现经镰刀菌诱导后均为上调表达,推测它们可能参与了泸定百合镰刀菌枯萎病的抗病反应途径。     

稻属单拷贝核基因TPI序列分析及其在疣粒野生稻鉴定中的应用

通过对稻属(Oryza L.)及其近缘属等18个禾本科植物单拷贝核基因TPI序列进行扩增和测序,分析其系统进化关系及序列差异,并设计鉴定疣粒野生稻(O.granulata)特异的分子标记.序列分析表明,栽培稻间TPI基因序列碱基变异少,野生稻相对变异丰富,其中疣粒野生稻变异尤为明显,根据疣粒野生稻的TPI基因序列特异位点设计引物,利用这一分子标记对疣粒野生稻进行准确鉴定.     

白粉病菌诱导的小麦表达序列标签(EST)研究(英)

白粉病是我国小麦的主要病害之一。尝试用表达序列标签 (expressedsequencetags,EST)技术 ,研究了经白粉病菌诱导后的小麦基因表达。从构建的普通cDNA文库中随机挑取约 15 0 0个阳性克隆并进行测序 ,获不重复ESTs序列 387条。不重复序列均获GenBank的存储号。其中 4 9.4 %的序列与已知基因同源 ,196条序列功能未知 ,84条序列为新ESTs。将不重复序列制备成高密度点阵膜 ,用差示杂交法筛选到几个抗病相关序列。     

白粉病菌诱导的小麦表达序列标签(EST)研究

白粉病是我国小麦的主要病害之一.尝试用表达序列标签(expressed sequence tags, EST)技术,研究了经白粉病菌诱导后的小麦基因表达.从构建的普通cDNA文库中随机挑取约1 500个阳性克隆并进行测序, 获不重复ESTs序列387条.不重复序列均获GenBank的存储号.其中49.4%的序列与已知基因同源,196条序列功能未知, 84条序列为新ESTs.将不重复序列制备成高密度点阵膜,用差示杂交法筛选到几个抗病相关序列.     

cDNA文库法在HCV-1b检测芯片研制中的应用

制备丙型肝炎病毒(HCV) 1b亚型诊断芯片并进行初步验证评价.采用cDNA文库法制备探针,用限制性内切酶Sau3AⅠ消化HCV 1b全长cDNA ,所得的酶切片段72℃补平加A ,AT克隆,PCR初步鉴定,并测序.将筛选出的片段打印在氨基修饰的玻片上制备成检测芯片并进行杂交验证分析.运用cDNA文库法,得到2 2个大小相对一致(2 5 0～75 0bp)的基因片段.序列分析表明,均属于HCV 1b基因,可以作为诊断芯片探针;样品标记采用限制性显示(restrictiondisplay ,RD)技术,标记后进行杂交.杂交结果显示,样品和诊断基因芯片杂交的敏感性和特异性均佳.批内和批间精密度CV值分别为5 4 %和6 8% ,表明用cDNA文库法收集片段是一种快速、简便制备芯片探针的实用方法.     

栽培稻与疣粒野生稻杂种F1代的基因组原位杂交鉴定

生物素标记的疣粒野生稻总DNA作探针,未标记的栽培稻总DNA封阻,对栽培稻与疣粒野生稻杂种F1体细胞染色体进行基因组原位杂交（Genomic in situ hybridization,简称GISH）分析。FITC检测表明,杂种细胞中来自瘛发粒野生稻的染色体有较多的黄色或黄绿色荧光信号,来自栽培稻的染色体只检出很少的信号。每条疣粒野生稻染色体上信号点所占的总的区域只是染色体的一小部分,表明疣粒野生稻染色体与栽培稻染色体的DNA序列大部分是同源的。     

小粒野生稻STK类抗病基因同源序列的克隆与分析

根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类(serine-threonine kinase,STK)抗病基因结构中保守结构域,设计引物,以小粒野生稻基因组DNA为模板,扩增获得10条STK类抗病基因同源序列.同源性分析表明其都具有STK保守结构域,与已克隆的STK类抗病基因有不同程度的相似性,为进一步克隆小粒野生稻中的STK类抗病基因提供依据.     

大豆抗病基因同源序列的克隆与分析

已克隆的植物抗病基因序列存在一些相对保守的结构区域。利用根据核苷酸结合位点(NBS)结构域扩增所获得的大豆抗病基因同源片段为混合探针,进行大豆cDNA文库筛选。通过筛库和5′RAcE-PcR扩增后,获得一全长基因KR3。KR3的长度为2353 bp,编码636个氨基酸。KR3蛋白在结构上与烟草抗花叶病毒N基因蛋白有较高的同源性,具有Toll／白细胞介素-1受体(TIR)、NBS等抗病基因的分了特征。Southern 杂交显KR3在基因组中为低拷贝：RT-PCR分析表明,该基因的表达受外源水杨酸的诱导。     

小麦抗病基因表达谱中的文库构建与筛选方法研究

以抗白粉病品系“百农 32 17×Mardler”BC5F4为材料 ,构建了白粉病菌诱导的普通cDNA文库和抑制消减杂交(SSH)cDNA文库。分别对两文库进行了一定规模的测序 ,获得普通cDNA文库不重复ESTs 387条和SSHcDNA文库ESTs 76 0条。将获得的ESTs与GenBank序列进行了BLASTn、BLASTx同源性分析。结果表明 :在普通文库中 ,一些参与光合作用与核糖体构成等的基因出现频率较高 ,而获得的抗病相关基因则较少。消减文库在构建方法、抗病相关基因的富集等方面具有明显的优越性 ,是目前抗病基因表达谱研究中的较好方法。利用高密度点阵膜杂交技术对两文库的筛选结果表明 ,该方法具有相对简便易操作、杂交膜可反复使用等优点 ;但也存在mRNA及同位素用量大等问题。经筛选 ,消减文库中有 5 4 1%的功能已知ESTs为抗病相关基因 ,被证明参与了小麦抗白粉病反应     

水稻白叶枯病候选抗性基因SHNLR的RGAs克隆及分析

旨在从含有疣粒野生稻抗白叶枯病基因的新种质SH5、SH76基因组中克隆抗病基因。利用RGAs法得到1个NBS-LRR类同源基因,暂命名为SHNLR(登录号为JF934724)。结果表明,SHNLR的开放阅读框长度为3 105 bp,编码1 034个氨基酸,含有CC、NB-ARC与LRR结构域,具备CC-NBS-LRR类植物抗病基因的结构特征。BLASTn和BLASTp比对显示SHNLR是单拷贝基因,未发现同源性较高且功能已知的基因,仅NBS保守域序列与番茄Prf基因的相似度最高。对SHNLR基因电子定位,发现其位于水稻第11号染色体的长臂末端,但与11号染色体上已定位或克隆的8个白叶枯病抗性基因具有不同序列或处于不同的位置。半定量RT-PCR分析表明,SHNLR在抗病新种质叶片中的表达明显受到白叶枯病菌Zhe173的诱导。因此推测SHNLR可能是1个与抗白叶枯病相关的R基因。     

炭疽芽胞杆菌基因芯片探针文库的构建

为制备炭疽芽胞杆菌的基因芯片探针文库,以炭疽芽胞杆菌毒素质粒pX01和荚膜质粒pX02为原材料,用Sau3A I酶切pX01和pX02质粒DNA,Taq DNA聚合酶72℃补平加A,经AT克隆,PCR初步鉴定筛选出炭疽质粒片段的阳性克隆．DNA自动分析仪对克隆片段进行序列测定;用生物信息学方法对其片段进行同源性分析;并将克隆的探针打印于玻片上,制备成炭疽芽胞杆茵基因芯片,与炭疽杆茵质粒DNA样品进行初步芯片杂交的实验,杂交实验的阳性率达到了90％以上,证明大部分克隆探针属于炭疽芽胞杆菌．炭疽芽胞杆菌基因芯片探针文库的构建为基因芯片探针的制备摸索出一条简便、高效、可行的方法．     

基因芯片技术检测细菌耐药性的研究进展

基因芯片技术是将无数预先设计好的寡核苷酸、cDNA、基因组 (Genomic)DNA在芯片上做成点阵 ,与样品中同源核酸分子杂交 ,对样品的序列信息进行高效的解读和分析 ,大规模获取相关生物信息。该技术应用领域主要有表达谱分析、基因突变及多态性分析、疾病诊断和预测、DNA测序、药物筛选、检测筛选耐药基因、微生物菌种鉴定及致病机制研究等。着重介绍了基因芯片技术检测细菌耐药性方面的国外研究进展。基因芯片可以大量、快捷地检测出细菌耐药性菌株以及引起细菌耐药性的基因的突变 ,由于其在检测中的高效率 ,因此要优越于传统的细菌学检测技术。基因芯片技术在细菌耐药性检测中有着巨大的应用价值 ,具有广阔的应用前景。     

疫霉侵染下辣椒幼苗消减文库的构建与初步分析

为了分离和鉴定辣椒中疫霉诱导基因,以高抗疫霉病辣椒品种L11为材料,以接种辣椒疫霉菌的幼嫩叶片为处理（tester）,以未接种自然生长的幼嫩叶片为对照(driver),利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建了疫霉侵染下辣椒幼苗的消减文库。从消减文库中随机挑取30个阳性克隆,提取质粒进行PCR鉴定,显示插入片段大小大部分集中在200～1 000 bp之间,文库质量良好。随机挑取40个克隆进行测序,共获得35个有效EST序列。经Blastx分析表明：有30个EST与GenBank中其他序列有同源性,5个EST为未知功能序列。已知功能的EST序列分别编码NAC转录因子、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、P450单加氧酶、叶绿素a/b结合蛋白、谷胱甘肽转移酶、几丁质酶等,这些蛋白涉及抗病信号传递、抗氧化作用、转录调控及光合作用等多种生理过程。本研究为抗病基因克隆和系统研究疫霉侵染下辣椒基因的表达奠定了重要的理论基础。