斑点叉尾鮰NK-lysin基因的cDNA克隆及融合表达质粒构建

以斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)NK-lysin-type1的成熟肽为研究目标,首先通过RT-PCR和巢式PCR从斑点叉尾鮰的鳃中克隆到编码NK-lysin成熟肽的基因,该基因编码由92个氨基酸残基组成的成熟肽;6个高度保守的半胱氨酸残基位于成熟肽内,它们被推测与NK-lysin的抗菌活性有关。为了进一步构建原核表达系统用于成熟肽的表达,pET-32a(+)被选择作为融合表达质粒,该质粒含有1个trxA融合头基因,与目的片段mNK-lysin连接后形成融合基因trxA-mNK-lysin,进而有助于在工程菌E.coliBL21(DE3)中的可溶性融合表达。通过PCR、EcoR I和HindⅢ双酶切处理以及DNA测序鉴定,证明pET-32a-mNK-lysin重组融合表达质粒已经被成功构建;将其转化至工程菌E.coliBL21(DE3)后的测序结果表明该重组质粒未发生任何DNA变异。     

兔抗肠道病毒71型截短VP1抗体的制备及鉴定

目的制备兔抗肠道病毒71型(EV71)截短VP1多克隆抗体,为EV71基础研究奠定基础。方法 RT-PCR扩增EV71VP1-N160基因(480 bp),以p GEX-6p-1为表达载体,构建重组表达质粒p GEX-6p-1-VP1-N160,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-VP1-N160融合蛋白,并对其进行纯化。以纯化的GST-VP1-N160融合蛋白作为免疫原,经背部皮下免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,ELISA检测多克隆抗体效价,间接免疫荧光法和免疫印迹检测抗体特异性。结果经双酶切鉴定,表明重组表达质粒p GEX-6p-1-VP1-N160构建正确;GST-VP1-N160融合蛋白相对分子质量为35 000~55 000,主要为不可溶性包涵体形式,其在大肠杆菌中高效表达;纯化后目的蛋白纯度约为95%,蛋白质量浓度1.9 mg/m L;免疫家兔后,免疫血清效价可达1012,抗VP1-N160多克隆抗体可以识别EV71原核表达的重组蛋白及天然病毒抗原中的VP1,特异性好。结论成功制备了抗EV71截短VP1多克隆抗体。     

大肠杆菌肠毒素ST1、LTB基因融合及其免疫原性研究

目的:构建大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因,并研究其表达产物的免疫原性。方法:采用PCR和基因突变技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增ST1突变基因和LTB基因,通过基因分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建含ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株,并用酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒,同时用ST1-LTB融合蛋白粗提物免疫小鼠,观察免疫攻毒保护效果。结果:构建了含ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pXSL1),ST1-LTB融合基因的序列和阅读框架均正确,其表达的ST1-LTB融合蛋白能够被ST1单抗和LTB抗体识别,且该融合蛋白已丧失天然ST1肠毒素的活性。ST1-LTB融合蛋白能够诱发小鼠产生抗体,该抗体具有中和天然ST1肠毒素的毒性作用。结论:构建的重组菌株BL21(DE3)(pXSL1)可以高效表达ST1-LTB融合蛋白,其表达产物ST1-LTB融合蛋白具有良好的免疫原性,为更有效地预防仔猪黄痢提供了一种新型基因工程菌苗候选菌株。     

表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白基因工程菌株的构建

利用PCR技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac基因、ST1突变基因和LTB基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含K88ac-ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)。经酶切鉴定和DNA序列分析证实,构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac-ST1-LTB融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测,重组菌株表达的K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够被ST1单抗、LTB和K88ac抗体识别。经乳鼠灌胃试验证实,表达的融合蛋白已丧失天然ST1肠毒素的活性。免疫实验结果表明,K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够诱发小白鼠产生抗体,该抗体具有中和天然ST1肠毒素的毒性作用,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪黄、白痢基因工程菌苗的候选菌株。     

斜纹夜蛾核多角体病毒VP39-GST融合蛋白的原核表达

用PCR的方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV）vp39全长基因。将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上,构建重组表达质粒pGEX-4T-vp39,转化大肠杆菌BL21（DE3）,在1 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下超量表达了与理论预测值相符的一个约60 kD的VP39-GST融合蛋白。VP39-GST融合蛋白的成功表达为进一步研究VP39在病毒侵染过程中与宿主细胞成分或病毒粒子蛋白间的相互作用奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒VP73基因主要抗原表位区的融合原核表达

人工合成VP73基因全长序列,利用DNAstar软件确定其中抗原性较高的区域,利用Primer Premier5.0设计一对特异性引物,通过PCR扩增得到243bp的非洲猪瘟病毒VP73基因片段（vp73l）。将该片段与表达载体pET-32a连接克隆至大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)DH5α菌株,经测序、菌落PCR和酶切鉴定,选取VP73L基因正向插入,读码框正确的阳性克隆。构建重组质粒并转化BL21（DE3）,经IPTG诱导,融合蛋白以可溶性形式在E.coli BL2（DE3）高效表达,经His亲和层析柱得以纯化。Western blotting显示,该融合蛋白能与兔抗非洲猪瘟病毒VP73多克隆抗体发生特异性反应。所得结果为进一步研究:分离纯化该重组融合蛋白;确证目标抗原蛋白VP73L免疫原性及其特异性,进而达到建立非洲猪瘟病毒的免疫检测方法奠定了必要的材料与技术基础。     

双歧杆菌质粒聚合酶基因表达系统的构建及其鉴定

目的构建可以在双歧杆菌表达外源性基因的系统。方法PCR扩增双歧杆菌质粒聚合酶基因（BPP）并连接至质粒pBS—T以形成重组质粒pBS—BPP。PCR扩增双歧杆菌内源性阿拉伯糖苷酶的启动子及分泌性信号肽DNA序列（ara）并连接至质粒pBAD—A以形成重组质粒pBAD—ara,然后将增强绿色荧光蛋白（eGFP）基因连接至质粒pBAD—ara以形成重组质粒pBAD—ara—GFP。采用基因重组技术重组含有ara、BPP、eGFP基因序列并可将外源性基因分泌表达于菌体外及锚定表达于细胞壁的质粒pBS—BPP—ara—GFP,激光共聚焦显微镜下观察含有pBS—BPP—ara—GFP质粒及对照质粒的E．coli,验证eGFP定位表达情况。结果所构建的表达系统可以在E．coli中表达eGFP基因。结论通过基因重组方法成功构建了双歧杆菌表达系统,其可将外源基因分泌表达于菌体外。     

西安地区EV71-VP1基因分析

目的:通过在原核表达系统初步构建EV71-VP1,对西安地区肠道病毒71型(EV71)的外壳蛋白VP1基因进行分析.方法:采集西安地区手足口病患儿的疱液、咽部分泌物进行病毒分离和RT-PCR检测;通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增肠道病毒71型(EV71)外壳蛋白VP1基因,构建重组表达质粒PQE30/VP1,转化到大肠杆菌BL21中,对VP1基因进行遗传学分析.结果:对肠道病毒71型(EV71)西安地方株VP1基因测序.并将其与阜阳株(序列号为EU913471)相比较,表明我国西安地区EV71分离株与阜阳株有较大差别,核苷酸差异约为4%.结论:西安地方株VPl基因与阜阳株相比,其核苷酸差异较为明显.这将为西安地区EV71的分子流行病学研究以及EV71所致疾病的预防和控制,打下良好的基础.     

节杆菌A.pascens DMDC12锰超氧化物歧化酶基因的克隆和表达

利用PCR技术对自行筛选的高度耐盐节杆菌Arthrobacter pascensDMDC12中的超氧化物歧化酶基因进行克隆,获得了节杆菌A.pascensDMDC12的SOD新基因(GenBank收录号为DQ779150)。将该基因与原核表达质粒载体pET-22b( )连接,构建重组质粒pET-sodAP,将质粒转化至表达宿主菌E.coliBL21(DE3),构建基因工程菌BL21/pET-sodAP。用异丙基硫代--βD-半乳糖苷(IPTG)诱导重组SOD蛋白表达,用酶活和SDS-PAGE分析表达产物,表达产物的相对分子质量为2.4×104,与sodAP推测的长度相同。表达目的蛋白占菌体可溶性蛋白的23%,比酶活达915.07 IU.mg-1,是对照菌株的8.73倍,具有较高的表达。本研究为进一步进行重组Mn-SOD的研究和应用奠定了基础。     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒vp39基因的克隆及其对S_f9细胞形态的影响

最近的研究发现：ＡｃＮＰＶ的ｖｐ３９基因与侵染密切相关［１］．在侵染过程中,ＶＰ３９蛋白与宿主的肌动蛋白结合,使其重排形成缆索（ｃａｂｌｅ）．导致细胞骨架发生变化有利于病毒编码的蛋白酶的水解．最后,子代病毒颗粒大量形成,宿主昆虫体全部液化成为脓水．可...     

大肠埃希菌热不稳定肠毒素B亚单位在婴儿双歧杆菌中的表达

目的将大肠埃希菌热不稳定肠毒素B亚单位（LTB）克隆到表达载体pBV220,使LTB基因在大肠埃希菌和双歧杆菌中稳定表达。方法将LTB基因克隆到表达载体pBV220中,再分别转化大肠埃希菌DH5a和婴儿双歧杆菌,使之表达,表达产物用SDS—PAGE鉴定。并通过家兔肠袢实验验证表达蛋白的安全性。结果LTB基因在大肠埃希菌和双歧杆菌中均可稳定表达,毒性实验证明LTB保留轻微的毒性。结论稳定表达LTB的双歧杆菌为今后的口服疫苗佐剂奠定了基础。     

猪细小病毒vp2基因的表达和类病毒颗粒的构建

利用PCR方法从病毒基因组中获得了vp2完整的编码区并经测序后克隆到原核表达载体pET-32(a)上。在大肠杆菌中诱导表达了VP2与Trx-His-STag的融合蛋白,通过免疫家兔获得了高特异性的兔抗血清。另外,将vp2克隆到pFastBacDUAL载体上,利用昆虫表达系统,即AcMNPV的Bac-to-Bac系统对vp2进行了表达,经SDS-PAGE和Westernblot分析,表达产物为64kD,并且该蛋白能在昆虫细胞中形成类病毒颗粒。     

副溶血弧菌染色体上毒素-抗毒素系统YefM-YoeB的鉴定

【背景】副溶血弧菌是一种重要的食源性病原菌,给公众健康带来严重危害。毒素-抗毒素系统广泛存在于细菌和古生菌基因组中,具有重要的生物学功能。【目的】在副溶血弧菌中鉴定新的毒素-抗毒素系统,为从毒素-抗毒素系统角度探讨该菌致病性和耐药性的分子机制奠定基础。【方法】通过在线工具预测副溶血弧菌染色体上的假定II型毒素-抗毒素系统;通过生长曲线分析和稀释点板实验检测假定毒素对大肠杆菌的毒性作用及相应抗毒素的抗毒性作用;通过反转录PCR确定毒素和抗毒素基因是否共转录;通过生物信息学分析确定新鉴定毒素-抗毒素系统的同源蛋白;通过LacZ报告实验确定抗毒素及毒素-抗毒素复合物对自身启动子的调控作用。【结果】副溶血弧菌染色体中编码6个假定II型毒素-抗毒素系统;基因vp1820的表达产物(VP1820)对大肠杆菌具有杀菌活性,vp1821的表达产物(VP1821)能中和VP1820的毒性;基因vp1821和vp1820共转录;vp1821-vp1820编码YefM-YoeB毒素-抗毒素系统;抗毒素YefM正调控启动子,YefM-YoeB复合物负调控启动子。【结论】在副溶血弧菌中鉴定了一个新的II型毒素-抗毒素系统,即YefM-YoeB,为进一步研究该系统对副溶血弧菌致病性和耐药性的影响奠定了基础。     

铁蛋白与口蹄疫病毒VP1在大肠杆菌中融合表达及纳米颗粒自组装

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的世界上最重要的畜牧疾病之一,严重影响世界畜牧业的发展,而疫苗免疫仍然是对疫情预防和控制的最有效手段。铁蛋白具有自组装和生物修饰的特性,在纳米疫苗等领域具有广阔的应用前景。选用O型口蹄疫病毒的vp1基因和幽门螺杆菌铁蛋白基因,通过融合PCR将vp1基因构建到铁蛋白亚基基因前端,在大肠杆菌中表达后通过His标签进行镍柱亲和层析纯化。将纯化好的重组蛋白进行Western blotting检测、质谱分析和透射电镜观察,发现重组蛋白VP1-Ferritin在大肠杆菌中获得表达,并可自组装成纳米颗粒。     

A novel cold-adapted phospholipase A(1) from Serratia sp. xjF1: Gene cloning, expression and characterization

The gene encoding a cold-adapted phospholipase A(1) (PLA(1)) from a psychrotrophic, glacier soil bacterium Serratia sp. xjF1 was cloned by two-step PCR (general PCR and TAIL-PCR). The full-length fragment comprised two open reading frames plA and plS. The gene product of plA encoding 320 amino acids with a molecular weight of 33.8kDa was identified as a phospholipase A(1). Its amino acid sequence exhibited the highest homology to PLA(1) of Serratia marcescens (71%). plS encoded a protein of 251 amino acids, which showed no enzymatic activity. The result of plA expression in Escherichia coli indicated that plS might improve the efficient expression of PLA(1) in E. coli. Furthermore, PLA(1) was functionally expressed in Pichia pastoris, yielding 41.8U/mL in a 3.7L fermentor. The purified recombinant phospholipase A(1) (rPLA(1)) had features typical of cold-adapted enzymes with a temperature optimum of 35°C and a maximum activity of 70% at 10°C. The rate of catalysis was optimal at pH 9.0 and the enzyme could be slightly activated by Ca(2+). This is the first report on gene isolation and expression of cold-adapted PLA(1).     

3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建和表达

目的 实现3α-羟类固醇脱氢酶基因在大肠埃希菌中的高可溶性表达.方法 从土壤中分离睾丸酮丛毛单胞菌,提取其基因组DNA,PCR扩增3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)基因,将它克隆到原核表达载体上进行诱导表达.提取细菌总蛋白进行SDS-PAGE分析并测定酶活性.结果 经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒,IPTG诱导表达后,获得融合蛋白,SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子量约为29kDa,与预期理论值一致;酶活性测定结果表明菌体可溶性总蛋白HSD酶比活性为142.81 U/mg,是对照BL21的12.97倍.结论 该研究成功地构建了3α-羟类固醇脱氢酶基因高效原核表达系统,为利用基因工程手段大量制备3α-HSD的工作奠定了基础.     

大肠埃希菌Mn-SOD基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

目的实现Mn-SOD基因在大肠埃希菌中的高可溶性表达,制备Mn-SOD的多克隆抗体。方法用PCR方法从一株野生型大肠埃希菌（E.coli）基因组中扩增Mn-SOD基因编码区．将它克隆到原核表达载体上进行大量表达和纯化,再用纯化的蛋白对新西兰大白兔进行背部多点注射,40d后取其血清,用Western-blot印迹实验测定抗体效果。结果SDS-PAGE分析表明SOD的表达量约为细菌总蛋白的50％;黄嘌呤氧化酶法测定表达蛋白活性,结果表明每毫克菌体可溶性总蛋白中表达产物酶比活为3921．77U／mg,是对照BL21的276．77倍;并制备了高效价的多克隆抗体。结论该研究成功地构建了大肠埃希菌Mn-SOD基因高效原核表达系统,所表达的Mn-SOD具有良好的免疫原性和免疫反应性。     

High-level expression of whiG——A key gene for Streptomyces differentiation in Escherichia coli

Six nucleotides located in the region of translation start site of whiG were changed. whiG was amplified by PCR technique. Reformed sequences were determined. This gene was directly subcloned into expression vector pET11c containing strong T7 promoter, and the recombinant plasmid was introduced into E. coli BL21(DE3), which could be induced by IPTG to produce T7 RNA polymerase. The SDS-PAGE result showed that whiG highly expressed in E. coli BL21(DE3), and the yield of whiG product was about 20% of insoluble proteins in cell. whiG product (σwhiG) was further identified by Western blot hybridization after making its antibody. whiG gene was subcloned into Streptomyces plasmid pIJ6021, and then it was introduced into sporulation deficient mutant C71 from Streptomyces coelicolor. The result showed that C71 could restore sporulation and σwhiG has biological functions.