H1亚型猪流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达及其间接

根据GenBank发表的H1亚型猪流感HA基因序列设计引物,扩增出HA基因片段.将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67B-H1,转化含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体获得重组转座子(rBacmid-H1),在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBV-H1),再感染细胞,收获目的蛋白.通过血凝试验、免疫印迹法、免疫组化分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物学活性.利用表达的蛋白作为猪流感间接ELISA的抗原,初步建立H1亚型猪流感的间接ELISA检测方法,并对内蒙古、辽宁和黑龙江等地送检的93份猪血清进行了检测,阳性率为31.18%,为研制开发快速、准确、简便的H1亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定基础.     

H1亚型猪流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达及其间接ELISA方法的初步建立

根据GenBank发表的H1亚型猪流感HA基因序列设计引物,扩增出HA基因片段.将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67B-H1,转化含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体获得重组转座子(rBacmid-H1),在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBV-H1),再感染细胞,收获目的蛋白.通过血凝试验、免疫印迹法、免疫组化分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物学活性.利用表达的蛋白作为猪流感间接ELISA的抗原,初步建立H1亚型猪流感的间接ELISA检测方法,并对内蒙古、辽宁和黑龙江等地送检的93份猪血清进行了检测,阳性率为31.18%,为研制开发快速、准确、简便的H1亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定基础.     

猪流感病毒抗原表位基因表达载体构建与免疫原性分析

根据猪流感病毒血凝素蛋白基因(Heamuglutinine, HA)的核苷酸序列, 设计、筛选HA蛋白氨基酸序列的主要表位多肽4个, 将4个片段以柔性连接串联成模拟蛋白, 核苷酸约为300 bp, 体外扩增该模拟蛋白基因, 插入到原核表达载体pET30a(+)中, 转染宿主菌诱导表达, 结果获得分子量为20 kD的表达蛋白, 该蛋白可与抗His-tag抗体、抗猪流感病毒H1N1、H3N2亚型高免血清发生免疫学反应。纯化后免疫小鼠, ELISA及血凝抑制(Heamuglutinine inhibitor, HI)试验检测, 小鼠产生针对多肽抗原的血清抗体, 同时还可检测到H1N1、H3N2亚型SIV血凝抗体。流氏细胞仪检测免疫组外周血淋巴细胞高于对照组, 说明该模拟蛋白具有与H1N1、H3N2亚型猪流感病毒相似的免疫原性及反应原性, 为H1N1、H3N2血清亚型猪流感病毒疫苗研制提供了新手段。     

猪流感病毒抗原表位基因表达载体构建与免疫原性分析

根据猪流感病毒血凝素蛋白基因(Heamuglutinine, HA)的核苷酸序列, 设计、筛选HA蛋白氨基酸序列的主要表位多肽4个, 将4个片段以柔性连接串联成模拟蛋白, 核苷酸约为300 bp, 体外扩增该模拟蛋白基因, 插入到原核表达载体pET30a(+)中, 转染宿主菌诱导表达, 结果获得分子量为20 kD的表达蛋白, 该蛋白可与抗His-tag抗体、抗猪流感病毒H1N1、H3N2亚型高免血清发生免疫学反应。纯化后免疫小鼠, ELISA及血凝抑制(Heamuglutinine inhibitor, HI)试验检测, 小鼠产生针对多肽抗原的血清抗体, 同时还可检测到H1N1、H3N2亚型SIV血凝抗体。流氏细胞仪检测免疫组外周血淋巴细胞高于对照组, 说明该模拟蛋白具有与H1N1、H3N2亚型猪流感病毒相似的免疫原性及反应原性, 为H1N1、H3N2血清亚型猪流感病毒疫苗研制提供了新手段。     

H3N2亚型猪流感病毒M1基因克隆及表达特性分析

从H3N2亚型猪流感病毒感染的鸡胚尿囊液中提取病毒基因组RNA,采用RT-PCR方法克隆M1全长基因,将M1基因亚克隆至pET-28a(+)表达载体中,构建重组表达质粒pET-28a-M1,将该重组质粒转化大肠杆菌BL21并经IPTG诱导表达。诱导产物经SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白M1获得大量表达,表达蛋白纯化后免疫Wistar大鼠制备多克隆抗体。Westernblotting检测结果表明制备的抗M1蛋白多克隆抗体可以识别大肠杆菌表达的M1蛋白和病毒感染细胞的病毒M1蛋白。构建M1基因真核重组质粒p3xFLAG-CMV-7.1-M1并转染Vero细胞,Western blotting检测表明抗M1蛋白多克隆抗体可以识别在Vero细胞中得到表达的M1蛋白,成功建立M1基因的真核表达系统。分析了病毒感染过程中M1蛋白的变化及其作为病毒复制指示分子的可能性。鼠源M1蛋白多克隆抗体的制备和M1基因真核重组表达质粒的构建,为进一步研究猪流感病毒的复制机理以及M1蛋白在病毒复制过程中的生物学功能奠定了基础。     

猪流感病毒H1N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达

克隆、表达和鉴定猪流感病毒H1N1 HA,NA基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。在成功克隆猪流感病毒H1N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a(+)上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a(+)/HA(截短),pET32a(+)/NA(截短),pGEX4T-1/NA,转化大肠杆菌BL21/Rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱和GSTrap 4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果显示,重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致。ELISA和Western blotting试验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。本研究成功克隆和表达了猪流感病毒H1N1 HA、NA基因序列,为猪流感病毒H1N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。     

禽流感病毒H5N1亚型HA基因表达及其产物的应用

根据GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因(HA)(GenBank:DQ023145)序列设计一对引物P1、P2,以重组质粒pUC-HA为模板扩增去除信号肽的HA成熟蛋白。PCR产物克隆入pMD18-T载体,经测序发现在967位A突变为T,形成一个终止密码子TAA。在突变位点附近设计两条有21个碱基配对的突变引物P3、P4,采用重叠延伸剪切法(SOE)用A定点替换T碱基,然后将正确的基因片段定向插入到表达载体pET-32a( )中,诱导表达获得正确的表达产物。Western-blot分析表明,表达的重组蛋白能与经BL21(DE3)大肠杆菌菌体裂解液处理的H5亚型禽流感病毒阳性抗血清发生特异性反应。利用纯化的重组HA蛋白初步建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体的间接ELISA方法,该方法可以代替传统的血凝与血凝抑制方法用于区分禽流感病毒的血清亚型。本研究为禽流感病毒亚单位疫苗及新型诊断试剂盒的研究奠定了基础。     

禽流感病毒H5N1亚型HA基因表达及其产物的应用

根据GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因 (HA) (GenBank DQ023145) 序列设计一对引物P1、P2,以重组质粒pUC-HA为模板扩增去除信号肽的HA成熟蛋白. PCR 产物克隆入pMD18-T载体,经测序发现在967位A突变为T,形成一个终止密码子TAA. 在突变位点附近设计两条有21个碱基配对的突变引物P3、P4,采用重叠延伸剪切法 (SOE) 用A定点替换T碱基,然后将正确的基因片段定向插入到表达载体pET-32a (+) 中,诱导表达获得正确的表达产物.Western-blot分析表明,表达的重组蛋白能与经BL21(DE3)大肠杆菌菌体裂解液处理的H5亚型禽流感病毒阳性抗血清发生特异性反应.利用纯化的重组HA蛋白初步建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体的间接ELISA方法,该方法可以代替传统的血凝与血凝抑制方法用于区分禽流感病毒的血清亚型.本研究为禽流感病毒亚单位疫苗及新型诊断试剂盒的研究奠定了基础.     

乳胶凝集试验检测H5亚型禽流感病毒血凝素抗体的研究

利用原核表达并经过纯化的H5亚型禽流感病毒的血凝素蛋白做为抗原,经碳二亚胺（EDAC）将表达产物和羧基化的乳胶共价偶联,并对偶联乳胶的蛋白量和偶联时间进行合理选择,建立H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白乳胶凝集试验的方法。临床检测H5亚型禽流感病毒实验免疫鸡血清126份,同血凝抑制试验相比,其敏感性为87.03％,特异性为88.8％,两者的符合率为87.30%。结果证明建立的方法可用于H5亚型禽流感抗体水平监测和流行病学调查。     

H3N2型猪流感病毒M2蛋白表达分析

流感病毒的M2蛋白在流感病毒复制中起着重要作用,是抗流感病毒的靶标分子。本研究以提取的病毒基因组RNA作为模板,RT-PCR扩增H3N2亚型猪流感病毒M2基因,分别构建了重组原核表达载体和重组真核表达载体,建立了M2蛋白的原核和真核表达系统。通过大肠杆菌表达系统,制备了M2重组蛋白,并免疫大鼠制备了多克隆抗体。Western blotting和间接免疫荧光方法检测表明所制备的抗体能识别真核表达的M2蛋白和病毒感染细胞后表达M2蛋白,具有良好的特异性。重组M2真核表达载体转染Vero细胞,表达的重组M2蛋白大小为20kDa,定位于细胞浆中,与病毒感染细胞中的M2蛋白定位相同。Western blotting检测表明M2蛋白在病毒感染细胞12h后才能检出,晚于NS1、NP和M1,属于病毒复制的晚期蛋白,可作为病毒复制晚期的指示分子。本研究为弄清M2蛋白在病毒复制过程中的生物学功能奠定了基础。     

H1亚型猪流感病毒HA基因DNA疫苗的构建及其对Balb/c小鼠的免疫效果评价

以A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)猪流感病毒HA基因为模板,通过RT-PCR技术扩增出HA基因,并将其克隆到pCI-neo真核表达载体中,成功构建重组表达质粒pCI-HA,瞬时转染vero E6和293T细胞,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(Immunoperoxidase monolayer assay ,IPMA)、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, iIFA)和蛋白免疫印迹（Western blot,WB）实验证明,HA基因能够在哺乳动物细胞中有效表达并具有良好的生物学活性。将重组质粒三次免疫8w雌性Balb/c小鼠后,ELISA试验和中和试验结果表明该重组质粒能够诱导小鼠产生较高的抗体滴度,并具有良好的中和活性。因此为H1亚型猪流感DNA疫苗的研究奠定了理论基础。     

禽流感病毒H5N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达

目的：克隆、表达和鉴定禽流感病毒H5N1血凝素基因（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶基因（neuramidinase,NA）序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法：在成功克隆禽流感病毒H5N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a（＋）上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a（＋）/HA(49~1587bp)、pET32a（＋）/NA(121~1141bp)、pGEX4T-1/HA、pGEX4T-1/NA,转化大肠杆菌BL21/rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2＋亲和层析柱和GSTra P4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果：重组蛋白在大肠杆菌中可以高效达,SDS PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,蛋白纯度占总蛋白的90％以上。ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论:成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 HA、NA基因序列,为禽流感病毒H5N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。     

流感病毒H1N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在酵母菌中的表达

在成功克隆流感病毒H1N1全长HA(Hemagglulinin,HA)、NA(Neuramidinase,NA) 基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMETA上,构建了重组表达质粒pMETA/HA(52~1 557 bp)、pMETA/NA(121~1 263 bp),电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。SDS-PAGE显示重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,蛋白纯度占总蛋白的95％以上,ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。成功克隆和表达了流感病毒H1N1 HA、NA基因序列,为流感病毒H1N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供了参考。     

一株H3N2亚型猪流感病毒广东分离株的基因组序列分析

从广东省疑似流感发病猪分离到1株H3N2亚型猪流感病毒(A/Swine/Guangdong/01/2005(H3N2)),对其各个基因进行克隆与测序,并与GenBank中收录的其它猪流感、禽流感和人流感的相关基因进行比较,结果表明,HA全基因与广东2003~2004年分离的H3N2猪流感毒株的核苷酸序列同源性在99%以上,与纽约90年代末分离的H3N2人流感毒株同源性在98.5%以上;NA基因与纽约1998~2000年分离的H3N2人流感毒株的核苷酸序列同源性在99%以上;NS基因、M基因的核苷酸序列与H1N1亚型猪流感毒株A/swine/HongKong/273/1994(H1N1)的核苷酸序列同源性较高,分别为97.9%、98.4%,与美洲A/swine/Iowa/17672/1988(H1N1)的核苷酸序列同源性分别为96.7%、97.1%;其他基因的核苷酸序列与H3N2人流感毒株具有很高的同源性。因此,推测其M和NS基因来源于H1N1亚型猪流感病毒,HA、NA及其他基因均来源于H3N2亚型人流感病毒。表明此H3N2亚型猪流感病毒为H3N2亚型人流感病毒和H1N1亚型猪流感病毒经基因重排而得到的重组病毒。     

甲型H1N1流感病毒HA基因在昆虫细胞中的截短表达

目的:利用Bac-to-Bac Baculovirus Expression System表达重组HA蛋白,Western blot及IFA方法鉴定其表达。方法:采用PCR方法扩增A/California/04/2009(H1N1)HA基因,将其克隆到pFastBacHT A载体上,重组质粒pFastBacHT-HA经双酶切及测序鉴定正确后,转化阳性重组载体进入E.coli DH10Bac感受态细胞中,通过Bluo-gal蓝白斑筛选、PCR鉴定获得重组转座子rBacmid-HA。从重组转座子中提取rBacmid-HA质粒DNA转染sf 9昆虫细胞,制备重组杆状病毒。重组杆状病毒感染sf 9细胞表达重组蛋白,Western blot及IFA鉴定重组蛋白表达情况。结论:成功构建了甲型H1N1流感病毒HA基因的昆虫杆状病毒表达载体,该表达载体转染昆虫细胞后制备的重组杆状病毒病毒滴度较高,重组杆状病毒表达的重组蛋白经Western blot 及IFA 鉴定后具有良好的免疫反应原性。     

共表达H5N1流感病毒M1和HA基因的DNA疫苗与腺病毒载体疫苗的小鼠免疫评价

为评价在小鼠体内表达流感病毒M1和HA基因诱导的免疫反应,制备共表达H5N1亚型禽流感病毒 (A/Anhui/1/2005) 全长基质蛋白1 (M1) 基因和血凝素 (HA) 基因的重组DNA疫苗pStar-M1/HA和重组腺病毒载体疫苗Ad-M1/HA,将其按初免-加强程序免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔14 d。第1、3次用DNA疫苗,第2、4次用重组腺病毒载体疫苗,每次免疫前及末次免疫后14 d采集小鼠血清用于检测体液免疫应答,末次免疫后14 d采集小鼠脾淋巴细胞用于检测细胞免疫应答。血凝     

江苏首例甲型H1N1(2009)流感病毒分离及其血凝素分子遗传特征分析

2009年6月12日,江苏确诊首例甲型H1N1(2009)病例。通过细胞和鸡胚分离系统,我们分离到一株具有较高血凝活性的病毒,命名为A/Jiangsu/1/2009。为了跟踪病毒的变异情况,我们开展了病毒的全基因组测序工作,在此基础上对其血凝素基因(Haemagglutinin,HA)的遗传特性进行了详细研究。分离株HA蛋白不具有多碱基HA裂解位点,具有低致病性流感病毒特点。与参考株A/California/04/2009相比,分离株A/Jiangsu/1/2009HA蛋白的有4个氨基酸发生了突变,但都不在已知的抗原位点上。分离株有5个潜在糖基化位点,这与近年来古典猪H1N1和北美三源重配猪H1病毒完全一致,保留了古典猪H1的特点。与禽流感H1病毒相比,分离株HA蛋白受体结合位点上的E190D和G225D发生突变,这可能成为新甲型H1N1(2009)在人际间传播的一个重要分子基础。此外,其它受体结合位点上相关氨基酸同时具有人和猪流感病毒的特点。本研究首次对早期流行的甲型H1N1(2009)流感病毒的HA蛋白的分子遗传特征进行了详细研究,对进一步监测病原变异具有重要指导意义。     

应用跨膜区置换的血凝素蛋白建立H7N9禽流感病毒抗体间接ELISA检测方法

【目的】由于H7N9禽流感病毒能够感染鸡,并且已经变异成了高致病性毒株,因此,鸡群中H7N9禽流感疫苗的免疫是一个趋势,而鸡群免疫后抗体检测方法的建立也十分必要。本研究旨在建立一种灵敏、高效、高通量的鸡群H7N9亚型禽流感病毒抗体间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法。【方法】通过昆虫杆状病毒表达系统分别表达属于W1、W2-A和W2-B分支H7N9流感病毒的3种野生型血凝素(HA)蛋白,以及跨膜区(TM)置换为H3 HA TM的W2-B分支HA蛋白(H7-53TM)。4种HA蛋白经过离子交换层析纯化后作为抗原,通过ELISA检测H7N9禽流感病毒抗体。【结果】ELISA特异性、敏感性和重复性试验结果显示,跨膜区置换主要影响HA蛋白ELISA检测的重复性,以H7-53TM为抗原的ELISA方法具有较好的重复性,其批内和批间变异系数小于10%,然而3种野生型HA蛋白与部分血清反应批内和批间变异系数大于10%,重复性较差,因此选择H7-53TM蛋白作为ELISA包被抗原。通过受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析,以H7-53TM为抗原的ELISA能够精准地区分H7N9亚型流感病毒抗体阳性和阴性血清。通过相关性分析,该ELISA方法与134份鸡血清HI试验结果具有显著强相关性(r=0.854 6,P0.000 1),并且与3个分支疫苗株免疫血清的HI试验结果也具有显著相关性(r0.5,P0.05)。【结论】跨膜区置换能够提高HA蛋白抗原检测H7N9禽流感病毒抗体的重复性,并应用跨膜区置换的HA蛋白建立了一种能够检测不同分支疫苗株免疫的H7N9亚型禽流感病毒抗体间接ELISA检测方法。     

禽流感病毒H9N2血凝素基因和神经氨酸酶因在大肠杆菌中的表达

克隆、表达和鉴定禽流感病毒H9N2 HA,NA基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。在成功克隆禽流感病毒H9N2全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a(+)上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a(+)/HA(截短)、pET32a(+)/NA(截短)、pGEX4T-1/HA、pGEX4T-1/NA,转化大肠杆菌BL21/rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱和GSTrap4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致。ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。本研究成功克隆和表达了禽流感病毒H9N2 HA、NA基因序列。为禽流感病毒H9N2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。     

H5N1亚型AIVHA抗原表位的高效表达及其抗原活性分析

血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白是禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的一个重要表面抗原性蛋白,在疾病诊断和防治上有重要意义。本研究为了探讨一种更为简便有效的HA重组蛋白表达途径,利用生物信息学软件,对H5N1亚型AIVHA基因编码的氨基酸序列进行分析,在分析其在大肠杆菌中的密码子偏好性、稀有密码子分布情况及有关蛋白的抗原性等重要特性后,构建了HA抗原表位重组表达质粒pET-32a(+)-HA。经测试,该重组质粒在1mmol/LIPTG诱导剂作用下诱导过夜,能在大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)中高效表达,并得到48.1kD大小的目的重组表达蛋白。重组蛋白用6×His-tagged protein纯化试剂盒纯化后,与福氏佐剂等量混合制备成抗原,以200μg/鸡的剂量皮下注射2月龄SPF鸡3次,采血分离血清。Western-Blot试验结果表明,该重组表达蛋白能分别与所制备的高免鸡血清及H5N1亚型AIV阳性血清发生特异性反应,在硝酸纤维素膜上出现特异性杂交带。说明本试验研究的HA抗原重组表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,保留了HA蛋白的抗原活性,提示该重组蛋白在H5亚型AIV的防治技术研究中具有重要的实际应用价值。