细胞凋亡与坏死的鉴别及研究方法进展

细胞死亡有两种模式;凋亡和坏死。本文从形态、生化指标等方面讨论两者的区别,并着重比较各种研究方法,包括检测凋亡的“金标准”、死亡抗原、凋亡特异蛋白、TUNEL和ISNT、彗星分析、流式细胞仪在鉴别凋亡和坏死中的作用,结合有关研究方法的进展寻求研究目的相关的优化选择。     

一种研究和鉴别悬浮培养红豆杉细胞凋亡与坏死的新方法

将在动物细胞凋亡研究中应用的Hoechst-PI双重荧光染色法与琥珀酸脱氢酶(SDH)染色法相结合,建立了一种更加完善的、能同时鉴别和研究悬浮培养的植物细胞凋亡及坏死的新方法——Hoechst-PI-SDH三重染色法(H-P-S法)。该方法可直接用于红豆杉悬浮培养细胞,无需对细胞进行去壁、固定及切片等其它方法所必需的步骤,在荧光显微镜下可鉴别活细胞、死细胞及凋亡细胞,并可同时观测细胞凋亡的全部过程。该方法简单、快速、准确,而且克服了因细胞膜通透性差异引起的对死、活细胞判断的困难,可在植物细胞凋亡的研究中广泛应用。     

受体相互作用蛋白3——细胞凋亡与坏死的调节阀

综述了受体相互作用蛋白(RIPs)蛋白结构和RIP3调控细胞凋亡与坏死机制的研究进展．受体相互作用蛋白3(receptor-interacting protein 3, RIP3)是丝/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一,该蛋白质家族包含一类高度保守的丝/苏氨酸激酶结构域．RIP家族激酶作为细胞应激传感分子,在调控细胞凋亡、细胞坏死和存活通路中发挥重要作用．近年发现,RIP3参与肿瘤坏死因子TNFα诱导的细胞程序化坏死的生物学过程．认识RIP3调控TNFα诱导的细胞凋亡与坏死不同死亡途径转换的分子机制,有助于发现肿瘤治疗的新策略．     

凋亡体与细胞凋亡

由细胞色素C（Cytochrome c,Cyt c）、ATP/dATP、凋亡酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1）以及procaspase-9（caspase-9的前体）构成的约700 kDa、具有很强的caspase酶激活活性的大分子蛋白复合物——凋亡体（apoptosome）,在哺乳动物线粒体凋亡途径和胚胎发育中至关重要。描述了凋亡体上各因子的结构、功能及其相互关系,线粒体介导的凋亡通路中凋亡体的形成及其调控。     

PGE2抑制肿瘤坏死因子诱导的成骨细胞凋亡

前列腺素E2(PGE2)通过自分泌或旁分泌方式调节成骨细胞的增殖和分化。本文以小鼠原代成骨细胞和成骨样细胞MC3T3-E1为实验材料,研究了PGE2对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的成骨细胞凋亡的调节作用。检测发现,振荡型流体剪切力(OFSS)刺激可诱导成骨细胞内环氧合酶2(COX-2)表达升高,进而促进PGE2合成,并抑制TNF-α诱导的成骨细胞凋亡。COX-2选择性活性抑制剂NS-398显著促进TNF-α诱导的成骨细胞内半胱天冬酶3(caspase-3)的激活,且呈时间依赖性。Hoechst 33258/PI染色检测发现,NS-398促使TNF-α诱导的成骨细胞膜通透性进一步增强,核染色质浓缩加剧,而PGE2可显著抑制这一效应。Caspase-3活性检测证实,NS-398显著促进TNF-α诱导的成骨细胞内caspase-3活性增强,外源性PGE2可有效对抗该效应。这些结果表明,内源性和外源性PGE2可抑制TNF-α诱导的成骨细胞凋亡发生。     

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体及其与肿瘤治疗前景

肿瘤坏因子相关的凋亡诱导配体（ＴＮＦ－related apoptosis inducing ligand,TRALL)属于肿瘤坏死因子家族,可激活肿瘤细胞的凋亡。本文介绍了ＴＲＡＩＬ的结构与功能,凋亡诱导途径及其肿瘤治疗应用前景。     

一种研究和鉴别悬浮培养红豆杉细胞凋亡与坏死的新方法

将在动物细胞凋亡研究中应用的Hoechst-PI双重荧光染色法与琥珀酸脱氢酶（SDH）染色法相结合,建立了一种更加完善、能同时鉴别和研究悬浮培养的植物细胞凋亡及坏死的新方法－Hoechst-PI-SDH三重染色法（H－P－S法）。该方法可直接用于红豆杉悬浮培养细胞,无需对细胞进行去壁、固定及切片等其它方法所必需的步骤,在荧光显微镜下可鉴别活细胞、死细胞及凋亡细胞,并可同时观测细胞凋亡的全部过程。该方法简单、快速、准确,而且克服了因细胞膜通透性差异引起的对死、活细胞判断的困难,可在植物细胞凋亡的研究中广泛应用。     

肿瘤坏死因子α和β对电离辐射诱导细胞凋亡的效应

为探讨肿瘤坏死因子（tumor necrosis foctor)α和β（TNFα和β）对电离辐射诱发细胞凋亡的效应及其机理,采用DNA琼脂糖凝胶电泳和FACS分析等方法,观察了人肿瘤坏死因子α（hTNFα)和β（hTNFβ)对^60Co-γ射线诱发细胞凋亡的形态学,生化学变化。结果显示：hTNFα或hTNFβ均可明显抑制^60Co-γ射线诱发正常人胚肺二倍体细胞（2BS）的凋亡,而相同剂量的hTNFα能促进^60Co-γ射线诱发的人体肺腺癌细胞系A549细胞凋亡,而对另一株人体肺癌SPC细胞的效应比A549降低1倍;hTNFβ能分别增强A549和SPC的细胞凋亡频率。由此认为,hTNFα和hTNFβ均可通过调节细胞的生理生化反应来改变细胞对电离辐射的敏感性,可保护正常细胞免受辐射损伤,而增加某些肿瘤细胞对辐射的敏感性。     

肿瘤坏死因子α和β对电离辐射诱导细胞凋亡的效应

为探讨肿瘤坏死因子(tumor necrosis foctor)α和β(TNFα和β)对电离辐射诱发细胞凋亡的效应及其机理,采用DNA琼脂糖凝胶电泳和FACS分析等方法,观察了人肿瘤坏死因子α(hTNFα)和β(hTNFβ)对~(60)Co-γ射线诱发细胞凋亡的形态学,生化学变化。结果显示:hTNFα或hTNFβ均可明显抑制~(60)Co-γ射线诱发正常人胚肺二倍体细胞(2BS)的凋亡,而相同剂量的hTNFα能促进~(60)Co-γ射线诱发的人体肺腺癌细胞系A549细胞凋亡,而对另一株人体肺癌SPC细胞的效应比A549降低1倍;hTNFβ能分别增强A549和SPC的细胞凋亡频率。由此认为,hTNFα和hTNFβ均可通过调节细胞的生理生化反应来改变细胞对电离辐射的敏感性,可保护正常细胞免受辐射损伤,而增加某些肿瘤细胞对辐射的敏感性。     

TNF家族新成员TRAIL及其受体与细胞凋亡

肿瘤坏死因子家族（ＴＮＦ）成员在细胞凋亡的调控中发挥重要作用。ＴＲＡＩＬ是最近发现的ＴＮＦ家族成员。在体外实验中,ＴＲＡＩＬ能诱导多种肿瘤细胞凋亡,而正常组织细胞却对其不敏感,提示ＴＲＡＩＬ可能成为一种新的抗肿瘤药物。ＴＲＡＩＬ受体的发现揭示了一种新的细胞凋亡调控机制,即通过假受体竞争性抑制配体,从而诱导细胞凋亡作用。ＴＲＡＩＬ可能与Ｆａｓ系统互补而发挥作用,并且与ＨＩＶ－１感染所致的Ｔ细胞减少及     

常规组织切片凋亡细胞原位末端标记方法

凋亡是有别于组织坏死的一种细胞死亡方式,多与基因调控的编程性死亡有关。准确地判断细胞凋亡对探讨程序化细胞死亡诱发机制具有重要意义。本文采用Biotin-16-dUTP对凋亡细胞内DNA断裂片段的末端进行标记,可原位检测常规组织切片上的凋亡细胞,方法具有敏感、直观、重复性好等优点。     

鸡胚早期神经系统发育中凋亡细胞的分布研究

研究鸡胚18S（Stage）神经系统发育中凋亡细胞的分布及其生物学意义。采用HNK－1和TUNEL免疫组化双染及改变切片方向的方法观察了神经管和神经嵴的凋亡细胞,结果显示：凋亡的细胞在间隔10张横向切片上呈非均匀分布,但在矢状切面凋亡细胞有节段性分布趋势。体节处连续神经嵴没有发现凋亡细胞,而体节与体节之间神经嵴迁离神经管呈游离状并有凋亡细胞,神经管腹侧面体节处间充质细胞呈现细胞凋亡节段性分布。结果表明：鸡胚早期神经系统发育中选择性发生细胞凋亡作用。     

原位缺口平移标记断裂DNA技术及其在检测流行性出血热尸检和实验动物组织中细胞凋亡和早期死亡的应用

原位缺口平移技术（ＩＳＮＴ）已被用于检测细胞核中ＤＮＡ断裂鉴别尸检组织中细胞的凋亡和坏死断裂、流行性出血热（ＥＨＦ）组织中存在散在单个细胞变性死亡和灶性梗死样坏死,前者带有细胞凋亡的特征。本文以ＥＨＦ肝脏和实验性病毒感染鼠脑组织为例,应用缺口平移法,在ＤＮＡ聚合酶或Ｋｌｅｎｏｗ酶的作用下,将地高辛标记的ｄＵＴＰ掺入合成到ＤＮＡ的断裂部位,通过碱性磷酸酶标抗地高辛抗体免疫组化法显示细胞ＤＮＡ的断裂,检测和鉴别细胞的凋亡和坏死。为分析死后解剖时间间隔及组织固定时间对该方法的影响,本文选用死后２～１４０ｈ尸检、经常规固定石蜡包埋后存放１０～３５年的标本和在１０％福尔马林固定了１０～３５年之后再进行常规处理的标本。实验时用蛋白酶Ｋ（ＰＫ）消化前后对比并分别在标记反应液中略去ＤＮＡ聚合酶作为阴性对照,用ＤＮＡ酶消化组织人为制造ＤＮＡ缺日作为阳性对照。结果发现,未经ＰＫ消化的组织,仅灶性肝细胞核ＩＳＮＴ标记阳性,经ＰＫ消化后,散在的带有凋亡特征的肝细胞胞核也出现阳性,灶性肝细胞胞核标记染色增强,但无论是蛋白酶消化与否,明确梗死样坏死的肝细胞均不被标记。结果还发现,死后２～２４ｈ内尸检组织和长时间（１０～３４年）存放的石     

用碘标记核酸检查鼻咽癌上皮细胞中的EB病毒基因

用同位素碘化钠直接标记核酸。以细胞内原位杂交实验检查鼻咽癌上皮细胞中的EB病毒基因。共检查病理确诊的10例鼻咽癌活检标本的细胞涂片,其中9例直接证实有EB病毒核酸。本文建立并改进了细胞内原位核酸杂交技术,首先使用重组的单链DNA作探针,并将碘标记的核酸用于原位核酸杂交实验。     

大鼠活体注射台盼蓝后肝和肾的组织学与组织化学变化的观察

大鼠连续4天腹腔注射1%台盼蓝后,观察隔天、隔周、隔二周后肝和肾的组织结构及PAS、AlP、AcP、G-6-Pase、Mg~(2+)-ATPase和SDH的活性变化。结果发现:肝细胞和肾小管的上皮细胞中有台盼蓝颗粒;肝PAS反应阴性;隔天后肝AlP、AcP、G-6-Pase和SDH活性增强,Mg~(2+)-ATPase活性减弱;肾的上述组化反应活性都减弱;隔二周后肝和肾的上述组化反应接近对照。实验结果提示:活体注射台盼蓝对肝和肾未构成实质性损伤,隔天后的组化变化可能是一种生理适应性反应。     

一种放大凋亡细胞Giemsa染色法及其在抗癌药物研究中的应用

本文介绍了一种用甲醇、冰醋酸、水处理细胞再经Giemsa染色的方法,经该方法处理后,细胞体积增大,凋亡细胞形态尤其胞核结构在普通光学显微镜下非常清晰.采用高三尖杉酯碱诱导四种不同类型肿瘤细胞凋亡,经放大细胞Giemsa染色之后,可获得清晰的不同时期凋亡细胞形态学表现及动态变化特征.进一步用琼脂糖电泳法检测四种细胞的DNA降解程度,结果表明,这种放大细胞的方法比琼脂糖电泳法更适用于形成凋亡小体之前细胞形态学特征的分析,为抗癌药物及细胞凋亡的研究提供了一种直观、准确的方法.     

共聚焦镜观察凋亡巨噬细胞内pH的变化

用透射电镜观察巨噬细胞的形态学改变,结果显示,地塞米松处理８小时后,大部分巨噬细胞发生凋亡特征变化：胞突缩短、减少,胞膜完整。胞体皱缩,胞质密度增加,其中出现大量空泡。胞核染色质边聚、浓缩。另外用激光扫描共聚焦显微镜（ＡＣＡＳ５７０）和ｐＨ荧光探针ＳＮＡＲＦ┐１／ＡＭ实时检测地塞米松处理巨噬细胞胞浆ｐＨ的动态变化。加入地塞米松,多数巨噬细胞胞浆马上发生快速和短期的碱化。随后,胞浆ｐＨ缓慢降低,胞浆酸化。结果表明,胞浆酸化是细胞凋亡发展的必然过程,胞浆碱化则很可能与细胞凋亡的发生相关,也可能与细胞种类、细胞功能状态相关     

原位末端标记技术观察双歧杆菌诱导实验性大肠癌的凋亡

本文以大肠癌裸鼠移植瘤为动物模型,将实验分为双歧杆菌注射组以及肿瘤对照组,用原位末端标记法观察了移植瘤组织的凋亡细胞百分率。结果显示：双歧杆菌注射组大肠癌移植瘤的凋亡细胞百分率为２６４２８±１８６２,而对照组则为２０６２±８８０,两者比较具有显著的统计学意义（Ｐ＜０００１）。提示青春型双歧杆菌可诱导大肠癌组织的凋亡,这可能是其抑瘤机理的一个方面     

利用原位杂交技术检测免疫球蛋白重链mRNA在T和B淋巴瘤内的表达

应用原位杂交技术和免疫组织化学法对８例Ｂ淋巴瘤和４例Ｔ淋巴瘤进行了ＩｇＨｍＲＮＡ和ＩｇＭ,κ,λ的检测。结果显示,８例Ｂ淋巴瘤ＩｇＨｍＲＮＡ均为阳性,位于胞核周围,有的ｍＲＮＡ阳性反应成点状位于胞质的一侧。７例胞质中ＩｇＭ,κ或λ为阳性。１例胞质内无ＩｇＭ,κ或λ,但胞核内ＩｇＨｍＲＮＡ阳性反应成点状分布,可能是初级ＲＮＡ转录。在Ｔ淋巴瘤中,只有一例胞核内出现初级ＲＮＡ转录,因为早期Ｔ淋巴瘤,也有Ｄ、Ｊ基因片段的重排     

早期干预改善缺氧缺血性脑损伤大鼠认知能力及其机制分析

目的研究早期干预对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)大鼠学习记忆功能的影响及其作用机制。方法选用SD大鼠建立宫内HIBD动物模型,随机分为非干预组和干预组,非干预组与正常对照组常规饲养,对干预组采取早期触摸和丰富环境刺激。干预28d后,通过三等臂Y型迷宫试验检测各组大鼠的学习记忆功能,而后取大鼠额皮质和海马组织进行病理观察,并采用DNA缺口原位末端标记法(TUNEL反应法)检测凋亡细胞,观察脑组织神经元凋亡情况。结果单纯HIBD组大鼠学习获得与记忆保持能力明显低于正常对照组(P<0·01),但HIBD干预组Y迷宫测试成绩则优于HIBD非干预组(P<0·01)。同时,HIBD非干预组脑额皮质和海马CA1区神经元缺失远较正常组多(P<0·01),而HIBD干预组与HIBD非干预组之间神经元数量的差异则不那么显著。但HIBD干预组脑额皮质和海马神经元凋亡百分率明显低于HIBD非干预组(P<0·01)。结论早期干预可减轻缺氧缺血性损伤脑组织神经细胞凋亡,该作用可能是早期干预促进HIBD大鼠脑功能修复的机制之一。