家蚕核型多角体病毒对小鼠的易感性及其蛋白组份的检测

家蚕核型多角体病毒(Bm-NPV)是一类环状DNA病毒。该病毒作为载体,应用在杆状病毒-昆虫真核生物表达系统。为确定家蚕基因工程表达系统产品对人的安全性,观察了该病毒对哺乳动物细胞株及对小鼠的易感性,建立了检测Bm-NPV蛋白组份的dot-ELISA方法,可用于生物表达器生产的产品中残存多角体病毒组份的检测。结果表明,芽生型多角体病毒(BV)在杂交瘤细胞和HL60细胞中不增殖。不同剂量包埋型多角体病毒(OV)灌胃感染小鼠,小鼠肝、肾组织切片的电镜观察及免疫组化染色未见到病毒颗粒。     

异源多角体蛋白对家蚕核型多角体病毒粒子的包装

利用PCR方法从AcMNPV基因组DNA中分离出多角体蛋白基因 ,将该扩增片段克隆到转移载体pBacPAK8中 ,得到重组转移载体pOAc。将该质粒DNA与线性化的Bm BacPAK6病毒基因组DNA共传染BmN细胞 ,得到了能形成多角体且不产生蓝色空斑的重组病毒hp BmNPV。纯化该重组病毒的多角体颗粒 ,并对多角体蛋白、病毒核酸及多角体病毒颗粒进行分析 ,发现AcMNPV的多角体蛋白能在家蚕细胞中大量表达且能在细胞内识别家蚕核型多角体病毒并组装成多角体颗粒 ;病毒基因组DNA因部分交换 ,其酶切行为发生了相应的变化 ;电镜观察发现经AcMNPV多角体蛋白包装的家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒大小为1 2 μm～ 2 9μm ,明显小于野生型家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒     

家蚕核型多角体病毒水平转移基因分析

为了探讨杆状病毒基因组的遗传进化模式,文章利用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和其宿主家蚕全基因组数据,进行了全基因组的同源性搜索和系统进化分析,结果显示,BmNPV的几丁质酶(Chi)基因、凋亡抑制蛋白3(IAP3)基因和尿苷二磷酸葡萄糖转移酶(UGT)基因为水平转移基因。这3个基因都来源于其宿主昆虫。通过核苷酸组成、密码子偏好性、选择压力等基因特征分析,发现BmNPV水平转移基因与其基因组序列存在明显差异,进一步验证水平转移基因的外源性。对3个水平转移基因的功能分析发现它们有利于杆状病毒在宿主昆虫中的侵染与繁殖,并提高杆状病毒在昆虫中的生存能力。     

以家蚕核型多角体病毒为载体高效表达天花粉蛋白基因

本文报道以家蚕核型多角体病毒为载体,在家蚕体内高效表达天花粉蛋白基因的结果。天花粉蛋白基因是用ＰＣＲ技术从栝楼基因组中分离的,该基因被插入到家蚕核型多角体病毒转移载体质粒ｐＢｍ-１的多角体蛋白基因启动子下游,构建成重组质粒ｐＢｍＴＣＳ。将重组质粒ＤＮＡ和野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕培养细胞,通过在家蚕培养细胞中进行同源重组和筛选,获得了无多角体的重组病毒ＢｍＴＣＳ。采用ＰＣＲ技术对重组病毒进行了鉴定,证实重组病毒合天花粉蛋白基因。重组病毒对家蚕的感染性不及野生病毒,提示表达产物对病毒的增殖有抑制作用。对重组病毒感染的家蚕血淋巴进行了ＳＤＳ-ＰＡＧＥ和免疫印迹分析,结果显示在蚕体血淋巴中的表达产物天花粉蛋白占总蛋白的５％。本实验为利用基因工程方法大量生产天花粉蛋白提供了又一条新的途径。     

家蚕核型多角体病毒ORF 75基因的克隆和表达

河南农业大学植保学院尹新明、安世恒、江志伟、胡鹏等博士、教授根据GenBank序列L33180设计引物用PCR技术扩增了编码家蚕核型多角体病毒bombyx mori nueleopolyhedrovirus,BmNPVORF75基因的DNA片段,将其连接至PMD18-T载体上,获得了该基因的成熟蛋白阅读框序列,用设计的酶切位点将目的基因从克隆载体上切下,     

茶尺蠖核型多角体病毒多角体蛋白单克隆抗体的制备

为了建立一种基于免疫反应检测茶尺蠖核型多角体病毒的方法,以纯化后的茶尺蠖核型多角体病毒作为抗原,免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,经间接ELISA筛选及克隆得到了一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为7D3。同时克隆并在大肠杆菌中表达了EoNPV多角体蛋白基因,获得重组多角体蛋白。经Western blotting鉴定,该抗体可与EoNPV的多角体蛋白特异性结合。利用制备EoNPV多角体蛋白的单克隆抗体,建立了间接ELISA测定EoNPV的方法。     

大尺蠖核型多角体病毒多角体蛋白基因的结构分析

大尺蠖核型多角体病毒(BsNPV)的多角体蛋白基因(ocu)定位在2．3kb的BamHl—H片段上,用xho1、sma1、HindIII和PstI构建了H片段的物理图谱,并测定了两端636bp序列。在5’端发现了杆状病毒ocu基因共有的典型特征,即：ATG起始区;启动子区(14bp保守序列);TATA box和CATA box区等。单一xhoI位点在ATG上游-15bp处,适于作为构建ocu基因转移载体的插入位点。在这一基因5’端序列中发现了五个反转重复单元CGAGC GCTCG,讨论了这一单元在杆状病毒ocu基因高效表达中的调控功能。     

家蚕核型多角体病毒基因polh的诱变分析

曾报道经化学诱变剂ＭＭＣ、９－ＡＡ和ＥＭＳ诱变的家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）多角体形态出现异常,继代分离的诱变ＢｍＮＰＶ基因组对ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ和ＢａｍＨＩ的酶切谱发生变化。研究进一步揭示,诱变ＢｍＮＰＶ的多角体外层蛋白晶格排列呈现紊乱;多角体蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳谱与对照组比较有显著差异;对多角体蛋白基因ｐｏｌｈ的测序结果显示,３组诱变ＢｍＮＰＶ的ｐｏｌｈ基因发生了多处碱基（氨基酸     

家蚕BmNPV多角体蛋白与外源蛋白共包埋入多角体的研究

为了探索家蚕核型多角体病毒多角体的包装特性,构建了一种不形成多角体但能大量表达绿色荧光蛋白(EGFP)的重组病毒vBmBac(polh-)-5B-EGFP,将其与野生型BmNPV共同感染BmN细胞,于荧光显微镜下观察到EGFP与多角体可以在同一细胞中同时表达。从感染的BmN细胞中收集纯化多角体,观察到多角体能被激发出绿色荧光,进一步利用Western blot证实多角体中含有EGFP。上述结果表明,多角体可以将自身病毒粒子以外的其他病毒粒子的成分包装进入多角体,表明多角体的包装机制中存在非特异性识别机制。     

氯霉素乙酰基转移酶基因在家蚕核型多角体病毒P10基因启动子控制下的表达

昆虫核型多角体病毒(NPV)P10基因属于晚期基因,为强启动子所控制,又是病毒复制所非必需的基因。我们对前报的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)P10基因,应用PCR技术进行ATG区定点突变,在ATG被突变的同时形成一个BglⅡ酶切位点,得到一个不含ATG的BmNPV P10基因启动子。将长为230bp的经突变后的BmNPV P10基因5’端(包括启动子所有特征)片段克隆进pMMTV·CAT质粒中,构建成一个CAT基因在BmNPV P10基因启动子控制下的pBmPl0·CAT瞬间表达质粒。该质粒通过转染进入经野生型BmNPV感染的BmN细胞中,CAT得以表达。证明BmNPV P10启动子是比较强的启动子,可以在BmN细胞表达外源基因,具备了作为表达载体启动子的特性。     

家蚕核型多角体病毒对小鼠的感染性研究

家蚕核型多角体病毒是一类双链闭合环状DNA病毒 ,该病毒被作为载体应用在家蚕生物表达系统 ;为确定该病毒的安全性 ,观察了该病毒对小鼠瘤细胞以及小鼠的感染性 ,结果显示芽生型家蚕核型多角体病毒在人DC杂交瘤细胞株和HL60细胞中无增殖 ;不同剂量的包埋型家蚕核型多角体病毒经口灌胃给小鼠 ,在小鼠肾、肝病理切片及电镜观察中未见病毒颗粒 ,用免疫组化试验检测小鼠肾、肝组织中的多角体病毒也为阴性。     

柞蚕成虫卵巢细胞株的建立及其对病毒敏感性的研究

建立了一株连续生长的柞蚕成虫卵巢细胞株Ap－4,测定了细胞株的生长曲线,细胞株的群体倍增时间为67h,该细胞株亦可以在无血清培养基SF－900Ⅱ中生长。用同源的柞蚕核型多角体病毒感染细胞后,观察了细胞的病理变化以及病毒多角体的形成。检测了病毒多角体的数量以及非包埋型病毒的TCID50数值,细胞株增殖的病毒对柞蚕幼虫和Ap－4细胞株仍具有感染性。     

油桐尺蠖核型多角体病毒（羊楼洞株）基因组特性

用多种限制性内切酶单酶切、双酶切分析了油桐尺蠖核型多角体病毒（羊楼洞株）基因组DNA,同时用[α－32p）－dATP对几种酶的酶切产物进行末端标记。结果表明,此株病毒基因组约129kb,组成比较单一。与国内其它分离株基因组大小及酶切电泳图谱均有较大差别。     

七株昆虫核型多角体病毒基因组同源性的测定

应用限制性内切酶图谱分析法,结合Southern印迹法和核酸杂交技术,对茶毛虫、棉蛉虫,油桐尺蠖、斜纹夜蛾以及蓖麻蚕等5种昆虫的7株核型多角体病毒DNA,进行了基因组同源性测定。结果表明,不同种昆虫多角体病毒DNA的酶切图谱不相同,DNA片段与不同源的DNA标记探针之间无杂交带出现。而同种昆虫病毒的不同分离株间,除少数DNA片段的电泳迁移率稍有不同,以及出现一些互不相同的亚克分子带之外,它们的DNA酶切图谱基本一致,並且几乎所有片段都可与同种的标记探钟杂交。对一些DNA片段迁移率的改变及亚克分子带出现的原因进行了讨论。