链霉菌菌株A与哈茨木霉T-23原生质体融合条件的研究

报道了链霉菌菌株和哈茨木霉菌株属问原生质体融合构建生防工程菌的前期研究成果,研究结果显示：链霉菌菌株A与哈茨木霉T-23分别以1000μg／ml庆大霉素和50～53℃热灭活120min作为遗传标记;融合系统采用聚乙二醇(PEG)作为促融剂,通过对PEG最佳分子量、浓度、处理时间的筛选,确立最佳融合技术系统,即内含0．05mol／L Ca^2 的35％ PEG6000,融合处理15min。所得融合子经过选择再生培养基培养后,在132株融合子中初步筛选出2株稳定的融合子。经孢子大小和DNA含量测定,确立一株为单倍重组体,另一株为杂合二倍体。     

林青链霉菌双亲灭活原生质体融合的研究

分别以紫外线、热灭活性林肯链霉菌947和9502原生质体,然后进行灭活双亲的原生质体融合,从16株融合子筛选到林青霉素高产株。用双亲的互补营养缺陷型对林肯链霉菌原生质体的制备、融合、再生的部分条件进行了研究。发现含0．4％Gly和34％蔗糖的SM培养基最适于实验菌株原生质体的制备、再生。聚乙二醇（PEG）分子量对原生质体融合影响不大,其在P缓冲液中的浓度却很重要。含50％PEG的P缓冲液最有利于原生质体融合。     

原生质体融合提高农抗武夷菌素的效价

从农抗武夷菌素产生菌不吸水链霉菌武夷变种菌株Co-N-31诱变获得两个突变株M35(Leu^-,孢子颜色灰色)和M46(ser^-.孢子颜色灰白色),并以此两突变株为直接亲本在25％ PEG1000诱导下进行种内原生质体融合。M35和M46原生质体再生率分别为3.72％和0.248％,重组频率为55.20％。采用间接法选择营养标记互补的稳定的原养型重组子,并从中获得一株高产菌株F31-24;其效价比原始亲本Co-N-31提高了82％。薄层层析结果表明,菌株F31-24和Co-N-31的发效产物在Rf值为0.50和0.26处均有斑点,但含量有异。测定斑点生物活性证明其均有抑菌活性。温室试验表明,菌株F31-24发酵产物对小麦白粉病的防治效果优于菌株Co-N-31。     

红霉素链霉菌无活性突变株原生质体融合的研究

红霉素链霉菌抗噬菌体菌株L156和生产菌株LDC2经诱变剂处理,得到了5个无活性突变株.用琼脂条法进行了共合成的互补测定,发现它们分属于3个不同类群,并初步确定了它们在红霉素合成代谢路线上发生障碍的前后顺序。我们选择了无活性突变株L156—19Em-和LDC2-4,Em-做新本,进行原生质体融合.通过溶菌酶处理时间与原生质体释放数量间关系的列比试验,不同培养基与原生质体再生频率关系的对比试验,和用琼脂块法检出融合体的试验,发现在30℃温溶中溶菌酶处理1小时即可达到最高的原生质体释放量。不同的再生培养基对于原生质体再生频率有较大影响,其中R2L培养基效果最好,其再生频率可达36％,不加特殊成份的一般斜面培养基(ZL培养基)也可以作原生质体再生,只是再生频率较低(1.2％)。用琼脂块法检出融合体是切实可行的,融合频率为1.6％。     

影响链霉菌原生质体形成、再生的因素

本文报道生长培养基成份,菌丝生育期,溶菌温度及再生培养基成份等对庆丰链霉菌,吸水链霉菌井冈变种原生质体形成和再生的影响,结果表明: 1.生长培养基中添加适量甘氨酸,和/或蔗糖,能增加菌丝细胞壁被溶菌酶消化的敏感性。2.对数生长期菌丝比静止期菌丝原生质体的再生活性高得多。3.菌丝溶解温度庆丰链霉菌以28℃为宜,吸水链霉菌井冈变种则以32℃为最适。4.再生培养基中高渗稳定剂的浓度对原生质体再生影响很大,对吸水链霉菌井冈变种来说,再生培养基R_2YE中的蔗糖以0.3M为宜,R_3中的琥珀酸钠以0.2M为宜。文中并对甘氨酸,蔗糖的作用机理及不同链霉菌原生质体制剂中含有不同比例的渗透敏感单位(即真正原生质体)的可能原因进行了讨论。     

林肯链霉菌双亲灭活原生质体融合的研究

分别以紫外线、热灭活林肯链霉菌 94 7和 95 0 2原生质体 ,然后进行灭活双亲的原生质体融合 ,从 1 6株融合子筛选到林肯霉素高产株。用双亲的互补营养缺陷型对林肯链霉菌原生质体的制备、融合、再生的部分条件进行了研究。发现含 0 .4 %Gly和 34 %蔗糖的SM培养基最适于实验菌株原生质体的制备、再生。聚乙二醇 (PEG)分子量对原生质体融合影响不大 ,其在P缓冲液中的浓度却很重要。含 5 0 %PEG的P缓冲液最有利于原生质体融合     

庆大霉素产生菌棘孢小单孢菌原生质体形成、再生及融合重组的研究

在含0．3％甘氨酸的液体培养基中培养庆大霉素产生菌——棘孢小单孢菌,其菌丝形态有明显的改变,易被溶菌酶消化细胞壁而释放大量原生质体。菌丝的培养龄影响其相应原生质体的再生活性(即再生成菌落的能力)。以72h为最佳,48及120h菌龄的原生质体再生频率依次相当于72h的40％和10％左右。以PEG4000为融合剂。用直接法检出重组子,重组频率约为10～6,融合重组子中有一些菌株庆大霉素的摇瓶发酵效价在1900u／m1左右,比对照菌株有很大的提高。     

庆丰链霉菌的致死接合现象

庆丰链霉菌各种衍生菌株的平板或斜面能自发产生麻点现象(pock),而当种内或种间杂交时,这种现象出现得更频繁。从麻点中心和周围孢子中可分别分离到具有产生麻点能力的菌株(Ltz~+)和本身虽然不能产生麻点但却可以作为检测麻点产生的指示菌株(Ltz~-)。 本文的研究结果表明,庆丰链霉菌的麻点现象是Ltz~+菌株和作为指示菌的Ltz~-菌株细胞之间在接合过程中的一种致死接合作用(lethal zygosis),致死率可达99％以上。决定这种致死能力的遗传因子能感染转移,可用已知质粒消除因子(如吖啶黄、高温预培养)处理及原生质体再生过程诱发消除。据此,我们认为庆丰链霉菌中产生麻点的能力很可能由质粒基因所决定。对于这种质粒的可能来源进行了讨论。     

链霉菌原生质体种间融合重组的研究 I．庆丰链霉菌和吸水链霉菌井冈变种的种间融合

本文报道庆丰链霉菌AS20l[11v]、MS30[Pr0一Ade—sm r］菌株和吸水链霉菌井冈变种VA4[His-]菌株原生质体的种间融合重组。AS201×vA4融合产生由二亲株营养标记互辅的稳定的原养型重组子,频率为1．09×10^-5．98×10^-6MS30 xvA4融台产物除原养型重组子,重组频率为5．7×10^-5外,还出现异核体及异质无性系(频率为2．8×10^-4一2．14×10^-5)。得到的原养型重组子,在孢子颜色、抗药性状、产物性质等方面显现广泛多样的变异。从中得到一个原养型重组菌株RvAl8,它所产生的抗菌物质,理化和生物性质与亲株产生的庆丰霉素和井冈霉素明显不同。     

吸水链霉菌应城变种和庆丰链霉菌种间原生质体融合及其融合子的生物学特性

本文报道利用抗生素产生菌吸水链霉菌应城变种Leu^-Sm^R。90-11菌株(Leu’smr)和庆丰链霉菌A_553-1菌株(Pro^-Sm^R)为亲株,以42％的PEG4000为助融剂,进行了种问原生质体融合,用间接法检出融合重组子38株,其重组频率约为4．5×10^-4。重组子除孢子丝形态外,孢子堆颜色、抗药性、抗菌活性和抗生素生物合成能力方面与亲株均有一定差别,而且不同重组子之间也不相同,特别在抗菌活性方面,其中重组子FL-42和FL-48不仅具有两个亲株所产生的4种抗生素的活性,而且还产生两个亲株不具有的活性物质。通过纸层析谱表明,这种活性物质,两个重组子之间也不相同。     

SQP1质粒上庆丰霉素生物合成基因的变异和重组

通过原生质体形成与再生手段可以获得庆丰链霉菌SQPI质粒上庆丰霉素生物合成基因发生突变的菌株(Qmrq-)。这些突变株,每两个为一对在斜面上混合培养,使之发生杂交,在所得到的子代菌落中,能检出相当数量回复了庆丰霉素生物合成能力的菌落。推测这些菌落的出现是庆丰霉素合成基因不同突变位点发生遗传重组的结果。     

酿酒酵母缺陷型原生质体的形成再生及融合条件的探讨

营养缺陷型作为酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)单倍体融合亲株的遗传标记。采用营养缺陷型LY—2和LY—4菌侏的对数生长前期的细胞,在0.5％的蜗牛酶作用时间40分钟,0.7MKCl高渗稳定剂的条件下,制备原生质体。两亲株的原生质体形成率分别为98.2％和91.0％。原生质体再生率为6.12％和2.13％。两亲株的原生质体在35％聚乙二醇(PEG, M.W.6000),50mMCaCl_2下诱导融合15分钟,在基本培养基上长出营养互补的融合菌株,融合频率为4.14x10_(-4)。本文就两亲株的原生质体形成和再生条件进行了初步的探讨,并进行了原生质体融合的尝试,     

吸水链霉菌NND-52-C基因工程宿主载体系统的构建

吸水链霉菌NND-52-C菌株是大环内酯类抗生素-阿扎霉素B的高产菌株。采用原生质体转化技术,将来自变铅青链霉菌TK24菌株的pU702质粒转化吸水链霉菌NND-52-C菌株的原生质体,建立了吸水链霉菌NND-52-C菌株的基因工程宿主载体系统。确定了NND-52-C菌株原生质体制备和再生的条件,其原生质体形成率达到10^8／mL,再生率约为0．2％,转化率为10^2-10^3个转化子／μg质粒DNA。     

金色链霉菌转化系统的优化

12 %的蔗糖浓度、 0 5 %甘氨酸、溶菌酶酶解 1h,是金色链霉菌原生质体制备的较优条件。采用麸皮再生培养基替代R2YE再生培养基 ,原生质体再生率、生长及筛选效果得到明显改善。P buffer介导的质粒转化效率高于T buffer,33%的PEG1 0 0 0是质粒转化金色链霉菌原生质的最适浓度。     

链霉菌11371原生质体的制备与再生

为选育链霉菌11371的高产Tetramycin菌株,摸索该菌株的原生质体的制备与再生。结果表明,链霉菌11371原生质体制备和再生的最佳条件为菌丝生长培养液中甘氨酸浓度为0．7％,培养温度为28℃,培养时间为42h,溶菌酶浓度为3mg／mL,酶解温度为37℃,酶解时间为90min。最佳再生培养基为R2YE培养基。     

卡那霉菌原生质体的分离和再生

本文报道了卡那霉菌原生质体的分离和再生的条件。实验证明用玻璃纸平板培养法,培养卡那霉菌菌丝体可以代替常规的摇瓶培养法,而且操作简单,培养时间短。在培养菌丝体的琼脂培养基中加入甘氨酸后,对菌丝体的生长具有抑制作用,而这种菌丝体对溶菌酶的敏感性与不加甘氨酸培养基中长成的菌丝体对溶菌酶的敏感性基本相同。单独使用溶菌酶就可以分离原生质体,不用再加裂解酶。用蒸馏水处理原生质体,不能裂解原生质膜;0.1％的SDS能完全裂解原生质膜,而且能保留完整的菌丝细胞,从而可以准确计算出原生质体悬浮液中残存菌丝细胞数。原生质体的再生和生长,受再生培养基成份的影响,非高渗性的卡那霉菌产孢子培养基,可用作再生培养基,且能得到较高的再生频率,同时再生菌落的生长也较旺盛。原生质体在再生过程中,和分生孢子一样首先萌发芽管,未发现有如Okanishi所述的扩张现象。卡那霉菌原生质体的再生能力在4℃冰箱中能保存24小时。     

庆丰链霉菌SQP1质粒的种间转移和表达

庆丰链霉菌A201菌株的SQP1质粒可以通过混合培养接合转移到井冈链霉菌VA4菌株的细胞中,转移频率为2—8％。接合子p菌株的形态特征和亲株VA4相似,但却获得了产生抑制细菌的抗生素的能力,这种抑制细菌的能力在遗传上是稳定的。高温预培养能使接合子P2菌株抑细菌活性受到消除,消除频率达10％以上。鉴定P2接合子的发酵产物证明包含二个抗菌物质,一个是它本来的产物井冈霉素,另一个是新获得的抑制细菌物质庆丰霉素,后者的产生是由于SQP1进入新寄主细胞的结果。     

赤霉素产生菌——藤仓赤霉菌融合重组的研究

以一对营养互补的缺陷型突变株作为亲本,酶法去除细胞壁制成原生质体,以等量相混,用30%PEG 4000诱导融合,在最低营养再生培养基上直接选择原养型融合重组子,重组频率约为10~-,同时产生一定数量的不稳定异核体,频率约为10~(-5)—10~(-6).融合重组导致色素产生和菌丝形态及赤霉素产生能力的多种变异.融合重组子中赤霉素产量的正变率为15.3%.其中RN2和RG14菌株的赤霉素产量比原养型出发菌株207提高25%以上.     

医药上的应用

抗生素和干扰素950954利用原生质体融合筛选红霉素产生菌[俄]/Kiric—heako.N.V.…∥Anltiblot.Khimioter。.一1993.38(6).一3～8[译自DBA,1994,13(:t6),94—091073 ’ 研究了接合和原生质体融合,以获得大量产红蟊素的重组菌8accharopolyspor口erythraea。用亚硝基脏处理制备菌株3和5突变株,该菌株稳定,其抗生素生产水平近于亲株。在接合和原生质体融合后比较了重组频率。表明后一种方法可获得较高的频率。用PEG一4000诱导原生质体融合,井_暴露在UV辐射(80%致死剂量)下刺激重组产生.可以轻微增加再生比率,提高抗生素生产水平。未处理…     

吸水链霉菌NND-52-C基因工程宿主载体系统的构建*

吸水链霉菌NND-52-C菌株是大环内酯类抗生素 阿扎霉素B的高产菌株。采用原生质体转化技术 ,将来自变铅青链霉菌TK2 4菌株的pIJ70 2质粒转化吸水链霉菌NND-52-C菌株的原生质体 ,建立了吸水链霉菌NND-52-C菌株的基因工程宿主载体系统。确定了NND-52-C菌株原生质体制备和再生的条件 ,其原生质体形成率达到 10⁸个 mL ,再生率约为0.2 % ,转化率为10²～10³个转化子 μg质粒DNA。