哺乳动物的基因工程(续三)

5.提高外源基因在动物细胞巾表达的途径:近10余年来,人们将各式各样的克隆基因导入哺乳动物细胞进行表达的兴趣日增。虽然大肠杆菌系统已能成功地表达人和动物活性蛋白,并有许多优点,但其致命的缺点是不能完成真核蛋白的转译后加工,而这类转译后加工对许多真核蛋白生物活性的表现至关重要。例如糖基化、磷酸化、酰胺化、羟基化、羧基化、磺酸化、硒化,以及信号肽的删除、链内和链间二硫键的正确连接和亚基的正确装配等等。     

基因工程表达蛋白包涵体的形成和纯化

基因工程表达蛋白包涵体的形成和纯化张庶民,祁自柏综述李河民审（中国药品生物制品检定所,北京１０００５０）在过去的几十年里,基因工程技术的引进给生命科学领域带来了一场革命。科学家们利用基因操作方法克隆出目的基因,然后将其组装入表达质粒,转染到宿主细胞中...     

利用哺乳动物细胞表达外源蛋白的研究进展

利用哺乳动物细胞表达外源蛋白已广泛应用于生物产品的制备,哺乳动物细胞是表达具有天然活性蛋白的最佳宿主,且具有易被转染,遗传稳定,产物可分泌表达,并易于纯化和大规模生产等方面的优势。本文对选择载体类型,载体元件（包括启动子,增强子,选择标记等）以及在哺乳动物细胞大规模培养过程中培养环境,细胞凋亡的抑制和控制细胞增殖和基因表达的Tet-switch系统等方面的进展作一综述,以探讨提高该系统表达产量的有效方法,更好地应用于生物制品的生产。     

用于药用蛋白生产的外源表达系统

种表达系统在重组蛋白生产上将长期共存.而通过遗传改造、基因组学、蛋白质组学等研究方法不断改进各种外源蛋白表达系统的性能,不断建立更加优越的外源蛋白表达系统则是大家共同努力的目标.     

哺乳动物的基因工程(续一)

2.载体的遗传标志--选择系统动物细胞被外源病毒载体转染通常是一种低效率的过程,其频率与细胞突变的频率是相近的,两者之间有何内在的联系尚不得而知。     

基因工程菌生产抗菌肽的研究进展

目前,利用基因工程菌生产抗菌肽,提供有效和稳定的方法是抗菌肽生产的热点之一。了解抗菌肽工程菌表达系统、生产量尤为重要,为此本文阐述了抗菌肽的生产方式,介绍了基因工程菌表达系统的种类、组成及特点,分析了基因工程菌生产抗菌肽的主要困难因素,并对近些年利用基因工程菌生产抗菌肽的进展进行了综述。     

乳酸乳球菌作为基因工程受体菌研究进展

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是一种"公认安全"的革兰氏阳性细菌,广泛存在于人、畜的肠道中并发挥许多重要的生理功能。由于它兼具安全性与益生性,近几年来研究者们开始关注用乳酸乳球菌作为受体菌来表达外源蛋白。随着生物技术的发展,人们对乳酸乳球菌基因表达及调控过程的认识不断深入并构建了一系列表达,成功地表达了许多外源蛋白,初步展示出良好的应用前景。主要对近年来国内外将乳酸乳球菌作为外源蛋白表达受体菌方面的研究进展做简要综述。     

基因工程菌发酵研究进展

基因工程菌发酵主要目标是获取高产外源基因表达蛋白。介绍并分析了基因工程菌发酵过程中表达系统、培养基、温度、pH值、溶解氧和诱导条件等因素对发酵的影响;论述了工程菌高密度培养所需的培养方式,并总结了基因工程菌发酵领域近年来的一些进展。     

大肠杆菌外源蛋白表达载体稳定性的研究进展

构建高产、稳定、可靠的质粒载体成为基因重组表达技术的研究重点之一。宿主细胞代谢反应和质粒不稳定性相关信息的缺乏,仍然阻碍着质粒载体的优化,成为限制外源蛋白在大肠杆菌中高效表达的瓶颈之一。主要论述了大肠杆菌外源蛋白表达载体的稳定性,分别从质粒和外源基因的本身特性、重组质粒转化对宿主细胞造成的影响及其他因素等方面阐述了对质粒载体稳定性的影响,同时介绍了相关的解决办法,从而为大肠杆菌表达系统高效表达外源蛋白提供参考。     

柴油降解基因工程菌的构建及降解特性

【目的】构建柴油降解基因工程菌,提高柴油降解速率,研究p450基因在柴油降解过程中的作用。【方法】将Alcanivorax borkumensis SK2的p450基因合成后,连接至烷烃响应表达载体p Com8中,构建该基因的表达载体p450-SK2/p Com8,并将其转入大肠杆菌DH5α中,通过SDS-PAGE检测该基因在大肠杆菌DH5α中的表达,并将重组质粒p450-SK2/p Com8转入柴油降解菌Acinetobacter sp.Y9中,构建基因工程菌p450-SK2/Y9,研究工程菌p450-SK2/Y9对柴油的降解特性及p450基因在构建的工程菌p450-SK2/Y9中的表达。【结果】PCR、酶切及测序结果表明重组质粒p450-SK2/p Com8构建正确。当柴油诱导浓度大于1%时,目的基因在大肠杆菌DH5α中的蛋白表达量较大,且随着诱导时间的延长而呈增加趋势。通过PCR检测构建的基因工程菌p450-SK2/Y9中的p450基因表明,工程菌构建正确,利用单菌株降解柴油时,宿主菌Y9与工程菌p450-SK2/Y9的柴油降解效率未见明显差异,但工程菌p450-SK2/Y9在构建的菌群中对柴油降解的促进效果明显。SDS-PAGE结果表明,p450基因在构建的工程菌p450-SK2/Y9中能得到准确表达,在混合菌中的表达量高于单菌株。【结论】柴油降解基因工程菌在混合菌群中对柴油降解具有促进作用,而在单菌株情况下未见促进作用,且p450基因的蛋白表达在混合菌中也高于单菌株,这对于提高柴油的降解速率及研究p450基因在柴油降解过程中的作用机理具有一定意义。     

基因工程菌表达D-氨基酸氧化酶研究进展

用分子克隆手段获得D-氨基酸氧化酶基因后,对其在不同表达系统如大肠杆菌系统、酿酒酵母和克鲁维乳酸酵母、博伊丁假丝酵母、巴斯德毕赤氏酵母系统及动物细胞内的表达作了介绍。     

哺乳动物的基因工程

没有任何一类生物,能像哺乳类那样与人类关系如此密切,又被研究得如此深入。在众多的哺乳类物种群中所存在的为数庞大的基因,是生物界历经30亿年漫长进化形成的。仅从这种意义上讲,这些基因对人类也是一个极其宝贵的自然资源。基因工程技术的发展,使我们对这类资源的利用提高到崭新的水平。如果我们能够充分开发它们,那对人类未来的发展所产生的深远影响,将是不可估量的。     

GNA成熟蛋白基因亚克隆及其原核表达载体构建

雪花莲外源凝集素（GNA）对刺吸式昆虫和某些咀嚼式昆虫以及多种线虫均有毒性,从含GNA前体蛋白基因的质粒中亚克隆出GNA的成熟蛋白基因MGNA,将MGNA基因插入大肠杆菌表达载体pET22b的不同位点,再经测序验证,得到了三种不同表达形式的GNA原核表达载体;22bG1(分泌型融合GNA蛋白）,22bG2(包涵体型GNA蛋白）,22bG3(分泌型天然GNA蛋白）,这为进一步在大肠杆菌中表达GNA和将GNA制成生物农药奠定了基础。     

大肠杆菌高效表达重组蛋白策略

大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早和目前应用最广的经典表达系统。利用该系统表达重组蛋白具有许多优越性,但其表达效率受诸多因素的影响。本文综述国内外利用大肠杆菌表达系统高效表达外源蛋白的策略,主要包括选择合适的启动子、改变信号肽结构、提高mRNA稳定性、提高翻译效率、表达稀有密码子、降低包涵体形成及蛋白降解,利用融合蛋白与分子伴侣、调控发酵条件实现高密度培养等。     

鲤鱼生长激素基因工程菌的发酵研究

对表达鲤鱼生长激素的大肠杆菌工程菌的发酵条件进行了详细的研究,探讨了发酵条件对工程菌外源蛋白表达量的影响,优化了影响工程菌发酵的各种条件,形成了一套工程菌小量发酵表达外源蛋白的工艺,为工程菌的大量生产奠定了基础     

基因工程菌的发酵研究

本文对大肠杆菌表达的rhGM - CSF 工程菌的发酵条件进行了详细的研究, 探讨了发酵条件对工程菌表达外源蛋白量的影响, 优化了影响发酵的各种条件, 形成了一套工程菌发酵表达外源蛋白的工艺, 并从工业化角度对工程菌的高密度高表达间的关系进行了探讨。     

海参溶菌酶枯草芽孢杆菌基因工程菌构建

通过基因重组等技术构建重组海参溶菌酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌,并对此基因工程菌进行生长曲线的测定和稳定性分析。结果表明,海参溶菌酶基因特异引物在400 bp处扩增出特异性条带,与预期的海参溶菌酶基因大小一致;重组表达质粒pHT43-SjLys经双酶切验证得8 000 bp和400 bp左右的片段;重组海参溶菌酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌与原始菌株WB600相比生长趋势基本一致,外源基因的插入对菌体的生理代谢未造成太大影响;在无选择压力的条件下,重组质粒的稳定性良好,连续传5次后的遗传稳定性为94%,并且提取质粒和双酶切验证后发现工程菌没有发现重排或丢失现象。表明重组海参溶菌酶基因工程菌pHT43-SjLys/WB600构建成功。     

产番茄红素基因工程菌的研究进展

番茄红素是一种重要的类胡萝卜素,具有许多生物功能和生物活性,尤其在保护人类健康方面起着重要的作用。随着番茄红素生物合成途径的阐明及其相关基因的克隆,运用基因工程手段调控番茄红素的合成已经成为可能。本文首先综述了番茄红素生物合成途径及合成途径中相关基因的克隆,然后对近年来构建的番茄红素基因工程菌进行了全面的总结,包括：运用DNA重组技术使异源微生物大肠杆菌、酵母等生产番茄红素,以及通过过表达特定基因从而提高霉菌等产番茄红素的量,最后分析了改造过程中存在的主要问题,并展望了未来的研究方向。     

芝田硫化叶菌新型α-淀粉酶基因工程菌表达条件的优化

对本室构建的生产海藻糖的基因工程菌株,即来自古细菌芝田硫化叶菌B12的新型α淀粉酶基因的工程菌的表达外源蛋白条件进行宿主菌,培养基,诱导时间,诱导温度和诱导菌浓的起始OD600等条件的优化,发现在宿主菌为大肠杆菌DH5α,培养基为改进的LB,诱导时间4小时,诱导温度41℃,OD600为06～08时,基因工程菌ESBAM中新型α淀粉酶的表达量最高,新型α淀粉酶活力也最高,与重组酶MTSase一起作用底物直链淀粉,经HLPC检测在反应产物中有海藻糖的生成。     

通过基因工程构建谷氨酸生产菌B44的研究

从大肠杆菌E.colik-12中通过PCR克隆出磷酸果糖激酶编码基因(pfkA),将其连到表达载体pCMVTNTTMvector。连接构建成重组质粒Ku-1,导入谷氨酸棒杆菌B4(已经诱变改造),并得到表达。酶活性测定表明Ku-1的pfkA基因在B44中得到表达(磷酸果糖激酶为128.6±0.86U/g蛋白)。解除磷酸果糖激酶对已经改造的谷氨酸的整个代谢途径的限制。同时,B44对糖转化率比B4(由出发菌株B1诱变而来)高10.64%,产酸率比B4高17.1%。