乙型脑炎减毒活疫苗走向世界——WHO版本的乙型脑炎减毒活疫苗制检规程正式发表

流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的感染主要引起中枢神经系统损害,是病毒性脑炎最严重的一种。目前仍然是许多亚洲国家的一种严重传染病,年发病率高达10／10万,病死率为25％,发病最高的为儿童和老人,并常伴有严重的神经系统后遗症。     

冻干乙型脑炎减毒活疫苗的冻干工艺优化研究

为了研究优化冻干乙型脑炎减毒活疫苗的冻干工艺,运用正交试验法L934考察不同冻干参数对该疫苗成品质量的影响,以外观、残余水分、病毒滴度以及热稳定性为直观分析指标,并对病毒滴度进行方差分析。结果显示,主干燥时间和主干燥真空压力对病毒滴度的影响有显著统计学意义(P<0.05)。优化的冻干参数为预冻温度-35℃、时间2h;主干燥温度从-35℃升温至-10℃,再由-10℃升温至33℃,总耗时16h,真空压力0.220mbar;二次干燥的温度维持于30℃,真空压力为0.001mbar,终点测试压力无变化时结束。对冻干乙型脑炎减毒活疫苗冻干参数筛选优化后,可得到较佳的冻干曲线,经验证该曲线适用于生产。     

应用蚀斑法和细胞病变法检测乙型脑炎减毒活疫苗病毒的比较

应用蚀斑法（ＰＦＵ）和细胞病变法（ＣＰＥ）检测乙型脑炎减毒活疫苗的病毒滴度,比较结果：①两种方法同时对同一批乙脑活疫苗进行１０次测定,ＣＰＥ滴定结果比ＰＦＵ滴定高１０Ｌｏｇ值,标准差Ｓ＝０１９６,变异系数ＣＶ％＝１９２％;②对不同批乙脑活疫苗检测,仍以ＣＰＥ法高于ＰＦＵ,差值Ｘ＝１２０,标准差Ｓ＝０３１,变异系数ＣＶ％＝２５６％;③ＰＦＵ法对同一批疫苗滴定３０次,乙脑活疫苗参考品滴定１８次,变异系数仅为１４８％和１２７％。结果表明,虽然ＣＰＥ法用于滴定乙脑活疫苗的滴度高于ＰＦＵ法,但蚀斑法系统误差小,重复性好,结果客观可靠,可避免ＣＰＥ法中由于细胞退化和工作人员主观判定造成的系统误差。     

乙型脑炎减毒活疫苗（SA14—14—2）在豚鼠体内保护作用的免疫…

本实验将乙脑减毒活疫苗ＳＡ１４－１４－２株以不同疫苗病毒量（３．８７ＰＦＵ／ｍｌ和５．８７ＰＦＵ／ｍｌ）分别一次免疫豚鼠,观察其对强毒攻击后抑制毒血症和抗体形成的能力。结果显示疫苗（５．８７ＰＦＵ／ｍｌ）免疫组豚鼠攻击前虽然中和抗体阴性或很低,但经攻击感染后不同时间内均未出现病毒血症,对照组豚鼠则于第２,３,４天全部出现病毒血症。表明一次活疫苗免疫后能有效地抑制病毒血症的产生。免疫后３０天虽然免疫     

麻腮风水痘联合减毒活疫苗病毒滴定方法研究

目的建立并验证MMRV联合减毒活疫苗病毒滴定方法。方法滴定MMRV疫苗中的每种病毒时,首先用特异性抗血清有选择地中和其他病毒成分,再根据每种抗血清与相应病毒的完全中和能力,确定各抗病毒血清的使用浓度。分别用CCID50法(麻、腮、风病毒)和蚀斑法(水痘病毒)检测MMRV疫苗中各病毒的滴度。结果使用该方法对MMRV联合减毒活疫苗进行滴定的实测值与理论值无显著差异,经验证其准确性和可重复性均显示良好。结论建立的MMRV联合减毒活疫苗病毒滴定方法可行。     

流行性乙型脑炎活疫苗细胞免疫检测方法的探索

本文建立了流行性乙型脑炎活疫苗细胞免疫检测方法。采用纯系Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ－２ｄ）小鼠制备效应细胞,以同一品系Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ－２ｄ）小鼠原代肾细胞为靶细胞。当效靶细胞比例为２０∶１,杀伤时间为４小时,ＭＴＴ反应时间为４小时,细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）杀伤作用最强。利用该法对乙脑活苗和死苗免疫小鼠进行了ＣＴＬ活性测定,结果表明该法重复性好,活苗诱导ＣＴＬ杀伤作用强于死苗     

乙型脑炎14-2株冻干活疫苗的生产研究

乙型脑炎病毒14-2株经地鼠肾细胞连续传23代,各代次的病毒滴度和回传乳鼠后的毒力都较稳定,与5-3株无差异。各代次的神经毒力和中枢神经外毒力也与5-3株相同。脑内感染12～14克小白鼠均不致死,皮下感染也不致病。用地鼠肾细胞经36℃培养4天,病毒增殖达到高峰,滴度为8.0～8.5logTCID50/0.2ml。病毒培养液的pH值为7.4～7.6时,病毒增殖高峰可持续3天。以1％明胶、5％蔗糖为保护剂,在冻干后无真空、不充氮的条件下。14—2株活疫苗在37℃可保存10天,室温(16～31℃)可保存4个月,5～8℃可保存一年,病毒滴度均无明显下降.冻干后充氮或不充氮病毒的滴度及稳定性看不出差异。冻干14—2株活疫苗融化后,用Eagle’s液稀释,置22～23℃8小时,滴度不变,若以生理盐水稀释,则可保持2～4小时;以蒸馏水稀释只能稳定2小时。     

不同代次毒种乙脑减毒活疫苗的滴度和安全性实验结果比较

为比较不同代次的乙脑毒种在疫苗制备过程中对疫苗质量的影响,特制备不同代次的工作种子SA14 14 2PHK7、PHK8、PHK9,检定合格后,分别用这几批毒种制备乙脑减毒活疫苗,检定和比较疫苗的滴度和各项安全性指标。实验表明SA14 -14 -2PHK7、PHK8和PHK9三个代次的乙脑毒种制备的乙脑疫苗平均滴度为 6. 43lgPFU/ml;乳鼠传代返祖试验均值为 1. 1lgLD50 /0. 03ml;致病力均为阴性。证实乙脑毒种SA14 -14 -2 10代以内的生物学特性是稳定的,对疫苗的影响无显著差异。10代以内的乙脑毒种可安全的用于疫苗生产。     

乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2全基因组序列测定及基因遗传稳定性

目的对乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2株进行全基因组序列测定和分析,并观察该生产株在疫苗制备过程中的基因遗传稳定性。方法根据DNA序列数据库(Gen Bank)公布的SA14-14-2株的序列,设计合成7对引物,提取疫苗生产株SA14-14-2及其工作种子批生产的3批原液、3批成品疫苗的病毒RNA,通过RT-PCR方法扩增SA14-14-2株的cDNA片段,分别克隆到pGEM-T载体,转化至大肠埃希菌DH5α中,挑取阳性菌落克隆、鉴定后测定全序列并对序列进行比较分析,观察毒株在传代的过程中病毒滴度的稳定性。结果乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2株基因组全长10 976 bp,编码3 433个氨基酸。3批原液和3批成品疫苗的基因组全长为10 977 bp,比较分析发现,在3'端非编码区10 701处多一个G核苷酸的插入。与DNA序列数据库(Genbank)登录号为D90195的全长序列同源性分别是99.9%、99.9%、99.9%、99.9%、99.8%、99.9%、99.8%,其中E蛋白的同源性均为100%。SA14-14-2生产株的病毒滴度为7.22 lg PFU/mL,原液和成品疫苗的滴度分别为7.32、7.23、7.32、6.86、6.92、6.70 lg PFU/mL。结论乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2基因稳定,具有良好的一致性,为乙型脑炎减毒活疫苗的质量的稳定性提供了可靠依据。     

麻疹减毒活疫苗检定用Vero细胞代次对病毒滴度稳定性试验的影响

目的了解麻疹减毒活疫苗检定用Vero细胞代次的稳定性范围。方法用DMEM培养液将Vero细胞137代连续传至173代,检测其细胞活力,并观察Vero细胞的形态,接种麻疹减毒活疫苗参考品进行病毒滴定及热稳定性试验。结果 170代以下Vero细胞形态良好,细胞活力在85%以上,麻疹减毒活疫苗病毒滴度热稳定性试验的结果:137~169代Vero细胞活力及原麻疹减毒活疫苗病毒滴度热稳定性试验无统计学差异(P>0.05),170代以上代次的Vero细胞活力及原麻疹减毒活疫苗热稳定性试验有明显统计学差异(P<0.01)。结论 169代以下Vero细胞为检定用麻疹减毒活疫苗最佳细胞代次。     

提高麻疹减毒活疫苗病毒滴度的研究

病毒滴度是麻疹减毒活疫苗的主要质量指标之一。本文结合生产实际,就有关提高麻疹疫苗病毒滴度的影响因素进行了探讨。试验说明,生产用毒种的质量十分重要,要保证麻疹疫苗的高滴度和生产的稳定,需要建立适合麻疹毒种的培养条件并保持培养条件一致,从而必须加强生产过程的全面质量管理。     

口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(人二倍体细胞)的稳定性研究

目的评价细胞工厂工艺连续生产的口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(人二倍体细胞)的稳定性。方法疫苗在-20℃放置24个月,检测病毒滴度、外观、抗生素残留量、无菌性,及对病毒血清型进行鉴别;2~8℃放置12个月检测疫苗稳定性;室温放置7周、37℃放置7 d检测加速热稳定性并冻融的稳定性。结果该疫苗-20℃可贮存24个月以上,2~8℃有效期可延长至12个月,且冻融不会影响疫苗的稳定性。结论疫苗质量稳定,各项检测结果均符合《中华人民共和国药典》三部(2010版)及企业《口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(人二倍体细胞)注册标准》。     

表达乙型脑炎病毒E蛋白重组减毒沙门菌活载体疫苗株的构建

目的:构建表达乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株。方法:克隆JEV E基因,将其插入表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-E,将重组质粒电转入鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(缺失asd、cya、crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-E);鉴定重组菌E蛋白的表达,测定重组菌的稳定性、生长曲线、安全性,以及小鼠的免疫试验和血清中和试验。结果:酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功;SDS-PAGE检测有目的蛋白条带;Western印迹证实表达的E蛋白能与猪抗JEV阳性血清特异性结合;重组菌株在体外营养选择压力下,可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可较稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾脏;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用,安全可靠;小鼠口服重组菌免疫,ELISA检测产生了抗JEV抗体;中和试验表明产生的抗体具有中和活性。结论:构建了能稳定表达JEV E蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(pYA3341-E),为研究乙型脑炎口服基因工程疫苗奠定基础。     

乙型脑炎病毒及其疫苗最新研究进展

流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)简称乙脑,是由乙脑病毒感染,流行在亚洲和太平洋地区重要的病毒脑炎,近年乙脑流行地区在不断扩大。目前尚无特效的治疗流行性乙型脑炎的方法,控制蚊虫传播和免疫接种是当前的主要防御手段。随着对乙脑病毒研究的深入,利用基因工程技术研制新型候选疫苗已成为预防乙脑新的发展方向。简要综述了乙型脑炎病毒的基因组结构及其蛋白功能,以及国内外乙型脑炎疫苗的最新研究进展。     

逆转录-聚合酶链反应在乙型脑炎减毒活疫苗生物反应罐清洁验证中的应用

为了对乙型脑炎减毒活疫苗生物反应罐清洁后乙型脑炎病毒(JEV)检测方法进行探讨,从GenBank中收录的乙型脑炎病毒的E蛋白基因序列设计一对引物,以乙型脑炎减毒株SA14-14-2培养物提取RNA作为模板,进行逆转录和PCR扩增。结果表明乙型脑炎减毒株SA14-14-2扩增出预期的特异性条带,阴性对照没有扩增出任何条带。聚合酶链反应与血吸附试验比较,有灵敏、快速、稳定性的特点,可用于生物反应罐清洁后乙型脑炎残留病毒的检测。     

流行性乙型脑炎减毒活疫苗（SA14—14—2）对免疫抑制剂处理小白鼠的致病性和免疫原性

免疫抑制剂环磷酰胺处理的12－14克三周龄小白鼠免疫功能抑制后,皮下注射乙脑SA14－14－2减毒活疫苗,未见小鼠出现特异性死亡。同时发现对活疫苗和死疫苗的免疫反应明显不同,处理后小鼠对活苗免疫仍有较好的免疫力,保护率为56％（三次抑制）和80％（二次抑制);而死疫苗免疫力明显下降,未抑制组为100％,抑制后九到10－20％。若小白鼠经乙脑活苗、死苗免疫后四周已建立免疫力后,再用环磷酰胺处理,并用强毒株P3攻毒,则对免疫反应影响不明显,两种疫苗均表现有较好的保护作用。     

麻疹减毒活疫苗不同剂量初免及复种后的免疫效果研究

目的评价麻疹减毒活疫苗（Measles Attenuated Live Vaccine,MV）不同接种剂量在初免及复种后的免疫效果及差异性。方法在同一观察区域、不同时段对适龄儿童分成两组采用MV0.2 ml与0.5 ml接种剂量分别在初免和复种后进行麻疹IgG抗体滴度测定。结果初免后,0.5 ml组较0.2 ml组IgG抗体阳性率、保护率分别提高5.28%与9.79%,抗体几何平均滴度（GMT）由1：543.03提高至1：813.51;初免加复种后,0.5 ml组较0.2 ml组阳性率、保护率分别提高5.32%与3.98%,GMT由1：740.49提高至1：1098.30;初免加复种较单一初免的阳性率、GMT差异有统计学意义。结论初免接种剂量0.5 ml可提高IgG抗体阳转率;复种0.5 ml与0.2 ml组的保护率差异无统计学意义,但0.5 ml组抗体阳性率、GMT较高。