地黄C3H基因的克隆及生物信息学分析

香豆酸-3-羟化酶属于植物中最大的蛋白酶细胞色素P450家族之一,在植物生命活动中发挥着重要作用。为了解地黄香豆酸-3-羟化酶基因RgC3H合成毛蕊花糖苷的功能,该研究基于地黄代谢组学分析获得KEGG途径中的C3H,采用多重比对在NCBI中获得同源基因的一个保守序列,并基于该保守序列和地黄SRA数据库,采用电子克隆和RT-PCR克隆技术获得地黄C3H基因全长CDS(RgC3H),对其进行生物信息学分析。结果表明:RgC3H基因全长为1 530 bp,且编码一个含509个氨基酸、分子量为57.91 kD、无信号肽的蛋白质; 基于氨基酸序列的结构分析显示,RgC3H有一个保守区域-P450结构域; 系统进化分析结果显示,RgC3H与芝麻和猴面花的C3H基因具有很高的同源性。上述结果为进一步研究RgC3H基因在地黄毛蕊花糖苷生物合成途径中的作用奠定了基础。     

华丽龙胆GsF3′5′H和GsFNS基因的克隆及表达分析

该研究以华丽龙胆(Gentiana sino ornata)5个不同开放阶段(H₁~H₅)的蓝色花冠为试材,利用RT PCR技术克隆GsF3′5′H和GsFNS全长序列,并进行生物信息学分析,比较GsF3′5′H和GsFNS在不同组织和不同开放阶段的基因表达模式。结果显示：(1)所克隆的GsF3′5′H和GsFNS基因分别包含1 560 bp和1 590 bp开放阅读框(OFR),并分别编码520和529个氨基酸。(2)结构分析显示,GsF3′5′H和GsFNS均具有典型的F3′5′H和FNSⅡ蛋白保守结构域。(3)系统进化树分析表明,GsF3′5′H和GsFNS亲缘关系最近的物种是三花龙胆(Gentiana triflora)。(4)qRT PCR结果显示,GsF3′5′H和GsFNS基因在根、茎、叶和花冠中均表达,其中GsF3′5′H基因在花冠H₃阶段表达量最高。GsFNS在根中表达量最高,其次在花冠H₄阶段两基因的表达均较高。研究推测,GsF3′5′H基因表达产生的飞燕草素苷和GsFNS表达产生的黄酮共着色作用可能使华丽龙胆的花冠呈更稳定艳丽的蓝色,为蓝色花分子育种提供重要的基因资源。     

鹅掌楸属GST家族基因的克隆与表达分析

该研究以鹅掌楸属植物为试验材料,在北美鹅掌楸和鹅掌楸转录组数据库中筛选出54条GST基因家族的EST序列,通过比对将其归为Tau、Zeta、Theta和Phi等4个亚类。在这4个亚类中各选取1条EST序列设计引物,通过反转录PCR(RT-PCR)与cDNA末端快速扩增(RACE)技术,从鹅掌楸属植物中克隆出4条全长分别为1 150、932、1 022和1 067bp的基因,并分别命名为LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a和LcGSTT1。对LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a和LcGSTT1这4个基因编码蛋白质的结构预测发现,其蛋白质的分子质量分别为25.17、25.34、24.49和28.09kD;理论等电点分别是5.60、6.53、6.66和9.20,即LtGSTparCb、LtGSTZlike、LtGSTF13a蛋白质属于酸性蛋白,LcGSTT1属于碱性蛋白;不稳定系数分别是33.01、36.97、43.19和47.96,即LtGSTparCb、LtGSTZ-like为稳定蛋白,LtGSTF13a、LcGSTT1为不稳定蛋白;α-螺旋(alpha helix)是这4个蛋白质二级结构的主要成分。利用在线软件TargetP并结合GST蛋白质在其他植物中亚细胞定位的结果,推测这4种蛋白质极有可能位于鹅掌楸属植物的细胞质内。实时荧光定量PCR分析结果表明,这4个基因在北美鹅掌楸各个组织中均有表达,其中LtGSTparCb和LtGSTF13a在叶中的表达量最高,在其他组织中的表达量均较低;LtGSTZ-like在花器官中的表达量最高,在叶中的表达量最低,在其他组织中的表达量居于两者之间;LcGSTT1在叶中表达量最高,花器官中表达量其次,在茎和叶芽中的表达量偏低。该研究结果可为鹅掌楸属GST家族基因的功能研究奠定基础。     

续随子ElFAD2基因的序列及表达特性分析

为了研究油酸脱氢酶(FAD2)基因ElFAD2对续随子(Euphorbia lathyris L.)中不饱和脂肪酸合成的调控作用,该研究在续随子转录组数据的基础上经筛选获得ElFAD2基因序列,并对其序列及表达特性进行分析。序列分析结果显示,ElFAD2基因全长1 907 bp,ORF长1 152 bp,共编码383个氨基酸,包含有典型的脂肪酸去饱和酶结构域。续随子ElFAD2蛋白理论等电点为8.08,属于稳定蛋白,包含4个跨膜区和3个保守的组氨酸簇。基于FAD2的系统发育分析表明,续随子与同科植物乌桕(Triadica sebifera L.)的亲缘关系最近。荧光定量PCR分析发现,ElFAD2基因在不同器官中均有表达,且在花后15 d的种子中表达量最高,在叶与花后30 d及45 d种子中的表达量相当,而在根、茎、花中的表达量最低。该研究结果为深入探讨续随子ElFAD2基因的生物学功能提供了基础数据,也为解析续随子种子中脂肪酸合成的分子机制奠定了基础。     

4种薯蓣属植物的分子鉴别和亲缘关系研究

为揭示薯蓣属植物的亲缘关系,根据叶绿体matK、rbcL、trnL-F和psbA-trnH序列片段,对小花盾叶薯蓣(Dioscorea sinopatviflora)、盾叶薯蓣(D.zingibiernsis)、黄独(D.bulbifera)和山药(D.polystachya)进行种间分子鉴别研究,并探讨这4个片段在薯蓣属植物系统发育上的意义。结果表明,4种薯蓣属植物共22份材料的matK、rbcL、trnL-F和psbA-trnH序列片段的长度分别为1026~1142 bp、1156~1178 bp、744~822 bp和355~599 bp。用PAUP 4.0b10和贝叶斯推断构建的系统发育树分析表明,云南的黄独与盾叶薯蓣的亲缘关系较近;小花盾叶薯蓣与盾叶薯蓣的亲缘关系很近;而非洲的黄独与云南的黄独的亲缘关系很远。但仅用这4个cpDNA片段还不能完全区分小花盾叶薯蓣和盾叶薯蓣,这说明基于这4个序列片段的系统发育证据与4种薯蓣属植物属内的分类划分并不十分吻合。     

转新型抗虫基因Vip3A棉花新种质的创制

该研究构建植物表达载体pBin438 Vip3A,通过农杆菌介导法转化棉花品种‘冀合713’,将新型抗虫基因Vip3A导入到棉花植株,创制对棉铃虫抗性的转基因棉花新种质。结果表明：(1)PCR检测Vip3A基因已经导入到棉花基因组中且能够稳定遗传。(2)室内抗虫性鉴定表明,与对照相比转基因植株对棉铃虫的抗性显著提高,并获得2株高抗和3株抗棉铃虫的转Vip3A基因株系。(3)Southern blotting结果显示,转基因株系BV01为单拷贝。(4)Elisa检测表明,外源Vip3A基因在BV01的根、茎、叶、花、种子中都有表达,在叶片中的Vip3A蛋白表达为苗期>蕾期>花期>铃期>吐絮期。该研究创制了新型抗虫转基因棉花材料,为培育棉花新型抗虫品种提供了种质资源。     

cry3A和vhb基因在转基因马铃薯中的表达

分别构建了含cry3A和cry3A+vhb基因的植物表达载体pBCry3A和pBC₃Vhb,并通过根癌农杆菌介导转化了马铃薯. 对转化再生植株进行PCR和DNA印迹分析表明,外源基因已整合到马铃薯基因组中, 且连续三代无性繁殖后转基因仍存在. ELISA分析表明cry3A基因在转基因植株中得到了高效表达, 在单转cry3A植株中最高表达量达0.1%, 转cry3A与vhb双基因株系中为0.065%. 水涝试验显示,转双基因且vhb mRNA的RT-PCR呈阳性的马铃薯植株,对低氧胁迫有较好的耐受性, 表明获得的上述转双基因马铃薯株系可能会具有很好的抗虫和耐涝性能.     

白及MSI1基因的序列分析及SSR多态性分析

通过对白及（Bletilla striata （Thunb.） Rchb.f.）的IRA1多拷贝抑制子（multicopy suppressor of IRA1,MSI1）基因序列进行生物信息学分析,并根据其核苷酸序列设计简单重复序列（simple sequence repeats, SSR）引物,进一步验证其在多个白及地方种中高度的保守性。运用Protparam、SOPMA、SWISS-MODEL等生物信息学软件分析白及MSI1蛋白的理化性质和结构域;DNAMAN、MEGA软件分别进行氨基酸多序列比对与系统进化分析;分析序列中的SSR位点并对多个白及品系进行PAGE检测和验证。结果显示,克隆得到的BSMSI1基因全长为3 700 bp,共编码了601个氨基酸残基,预测蛋白质分子量为65 309.75 kg/moL,等电点为5.95,表现出高度的保守性,而且发现不同地区的白及BSMSI1基因在遗传上具有多样性。本研究拓展了对 BSMSI1序列的认识,新开发标记能有效应用于MSI1基因的检测和育种鉴定,同时也可为其他物种的MSI1基因研究提供参考。     

百合LbCAT和LbGPX基因的克隆与表达分析

以切花百合(Lilium brownii var. viridulum)‘卡瓦纳’cDNA为模板,克隆了过氧化氢酶(LbCAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(LbGPX)基因。序列分析表明,这2个基因分别包含1 479 bp和519 bp的开放阅读框(ORF),编码492个和172个氨基酸。进化分析结果表明,LbCAT蛋白与岷江百合CAT蛋白的氨基酸序列相似性最高(99.19%),且亲缘关系最近;LbGPX蛋白与油棕GPX蛋白的氨基酸序列相似性最高(78.61%),亲缘关系最近。qRT PCR结果显示,LbCAT和LbGPX在百合根、鳞茎、叶和花中都有表达。LbCAT在叶中表达量最高,LbGPX在花中表达量最高。这2个基因在百合花蕾的生长发育过程中均有表达,且表达量逐渐增加;在PEG处理后2个基因的转录水平升高,但独角金内酯(SLs)处理却显著降低了这2个基因的转录水平;该结果为百合抗逆性机理研究以及抗逆育种奠定了基础。     

对HCMV UL54 mRNA片段特异性切割的M1GS构建

人巨细胞病毒是一种DNA病毒,在人群中一般呈亚临床感染和潜伏感染。为研究病毒基因沉默工具和抗病毒制剂,以人巨细胞病毒UL54基因mRNA序列设计互补的外部引导序列,共价结合到大肠杆菌来源RNaseP催化核心M1RNA上,从而构建成M1GS-T6核酶。通过对DNA聚合酶UL54基因亚克隆片段转录产物体外切割研究,证实该核酶具备对UL54mRNA片段的特异切割能力。     

ITS phylogeny of West Asian Heracleum species and related taxa of Umbelliferae–Tordylieae W.D.J.Koch, with notes on evolution of their psbA-trnH sequences

Summary Heracleum is a large and taxonomically complex genus of the Umbelliferae–Tordylieae. The phylogenetic relationships of West Asian Heracleum species and related taxa were explored using data from sequences of the internal transcribed spacer (ITS1 and ITS2) region of nuclear ribosomal DNA. The data set consists of 56 species, of which 47 were analyzed for the first time; it represents all subdivisions of the genus Heracleum, as well as some representatives of Pastinaca complex. Heracleum was shown to be a polyphyletic genus, as its species fall into two different clades, one of which comprises also Symphyoloma and Mandenovia. Section Pubescentia was confirmed, in contrast to the sections Villosa and Heracleum being polyphyletic. A separate position of the section Wendia was supported. H. marashicum was shown to be a member of a clade comprising Pastinaca and related genera. The sequences of chloroplast psbA-trnH intergenic spacer, the region recently proposed for DNA barcoding in plants, were also analyzed for 33 species, representing all principal clades within Heracleum and its relatives. They have been proven to be very similar and not suitable for DNA barcoding in this group. However, some sequence variation was revealed. This variation could be explained by the combination of such evolutionary events as inversion and duplication. It was shown that these events are rather common in Tordylieae and can occur independently in different lineages. The evolution patterns of psbA-trnH spacer are hypothesized.     

Biological control of postharvest fungal rot of yam (<Emphasis Type="Italic">Dioscorea</Emphasis> spp.) with<Emphasis Type="Italic">Bacillus subtilis</Emphasis>

The potential of isolates of Bacillus subtilis from yam farm soil to control rot of yam in storage barns was investigated. Yam tubers inoculated in vivo with B. subtilis showed no rot while those inoculated with Aspergillus niger, Botryodiploidia theobromae or Penicillium oxalicum showed considerable rot. The set of yams in which B. subtilis and the fungi were simultaneously inoculated produced rot whereas those in which B. subtilis was inoculated a day before the fungi was inoculated were totally reduced or free of rot. Many fewer fungi were isolated from the surface of tubers treated with B. subtilis than from the untreated (control) and there was high recovery of B. subtilis (99–100%) throughout the period of storage. Rot build up was faster in uninoculated control tubers or those inoculated with a spoilage fungus, while those treated with the antagonist were totally reduced or free of rot. The culture filtrate of B. subtilis prevented spore germination in some spoilage fungi. The importance of this study in relation to farmers in developing countries is discussed.     

A molecular phylogeny of the genus Gagea (Liliaceae) in Germany inferred from non-coding chloroplast and nuclear DNA sequences

The systematics of the mainly yellow flowered Gagea species complex (Liliaceae) has long been considered difficult because only a few phenotypic features within this genus and as a result of hypothesized interspecific hybridisation. A molecular phylogenetic study of seven Gagea species (G. bohemica, G. lutea, G. minima, G. pomeranica, G. pratenis, G. spathacea and G. villosa) from Germany has been undertaken, based on plastid DNA sequences (trnL(UAA)-trnF(GAA), psbA-trnH) and on the nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS). Sequence divergence within the Gagea species ranges up to 15.5% for psbA-trnH, 22.0% for trnL-trnF and 23.7% for ITS (ITS1 + 5.8S rRNA + ITS2). Two subspecies of Gagea bohemica: G. bohemica subsp. saxatilis and G. bohemica subsp. bohemica are characterized by trnL-trnF data and morphological features. Analysis of the ITS region shows that G. pomeranica represents a hybrid of G. pratensis and G. lutea. Lloydia serotina was initially used as an outgroup species, but it was placed within the investigated Gagea species in the psbA-trnH and the trnL-trnF phylogenetic tree.     

Bothropstoxin-I: Amino acid sequence and function

The complete amino acid sequence of bothropstoxin-I (BthTX-I), a myotoxin isolated fromBothrops jararacussu snake venom, is reported. The results show that BthTX-I is a Lys₄₉ phospholipase A₂ (PLA₂)-like protein composed of a single polypeptide chain of 121 amino acid residues (M_r=13,720), containing one methionine and 14 half-cystines. Although deprived of any detectable PLA₂ activity, BthTX-I reveals a high degree of sequence homology with Asp₄₉-PLA_2s and with other Lys₄₉-myotoxins. Critical mutations—such as Leu₅ for Phe₅; Gln₁₁ for X₁₁; Asn₂₈ for Tyr₂₈; Leu₃₂ for Gly₃₂; Lys₄₉ for Asp₄₉; and Asp₇₁ for Asn₇₁—which are apparently involved with the decreasing or elimination of PLA₂ activity, have been detected. The same mutations occurred in myotoxin II fromBothrops asper venom, but five extra changes—namely, Pro₉₀ for Ser₉₀; Gly₁₁₁ for Asn₁₁₁; His₁₂₀ for Tyr₁₂₀; Phe₁₂₄ for Leu₁₂₄; and Pro₁₃₂ for Ala₁₃₂—have been found relative to myotoxin II.     

秦艽1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶基因(GmHDR)的克隆和表达分析

龙胆苦苷(gentiopicroside)等裂环烯醚萜苷类化合物是中药秦艽中主要的有效成分,属于萜类化合物的衍生物,1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶(1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase,HDR)是植物萜类物质合成的关键酶之一。该研究在实验室高通量测序的基础上,采用RT-PCR方法克隆了秦艽HDR基因(即Gm HDR基因),利用生物信息学的方法分析了Gm HDR编码氨基酸序列的理化性质、信号肽、转运肽、亚细胞定位、保守结构域和高级结构等特征,并采用实时定量PCR分析了HDR的表达模式。结果表明:秦艽Gm HDR基因包含一个完整的长1 392 bp的ORF框,编码463个氨基酸;Gm HDR与萝芙木、艾菊等植物HDR蛋白具有很高的一致性(≥84%),无跨膜结构域,有叶绿体转运肽等结构,主要定位于叶绿体中。实时定量PCR结果显示,Gm HDR基因在秦艽的花中进行表达量高,在叶、茎和根等部位表达较低。Gm HDR在序列上与其他植物的HDR蛋白序列特征上存在很大的相似性;Gm HDR基因主要在秦艽花中表达,可能主要参与花中萜类物质的合成。该研究结果可为今后研究秦艽环烯醚萜类化合物的生物合成机制提供依据。     

红树植物杯萼海桑SAMS基因的克隆与生物信息学分析

红树植物杯萼海桑是最耐盐的红树植物之一。S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase,SAMS)是S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)生物合成途径的关键酶。SAMS作为一个逆境胁迫响应蛋白在植物的耐盐调控中发挥着极其重要的作用。本文结合杯萼海桑根的转录组注释,根据编码区序列设计引物,通过PCR克隆杯萼海桑SAMS基因的编码区cDNA,并对其进行生物信息分析,为研究杯萼海桑适应逆境的机制奠定理论基础。结果显示PCR扩增了一个长1 182 bp的基因片段,该片段编码由393个氨基酸组成的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。同源性比对及进化树分析显示杯萼海桑的SAMS氨基酸序列进化上相对保守。本研究首次从红树林植物杯萼海桑中克隆S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因,并获得其编码区序列,为进一步研究杯萼海桑应对逆境胁迫的分子生物学机制与胁迫相关基因调控网络奠定基础。