Ⅰ～Ⅳ型登革病毒包膜蛋白B细胞中和表位的鉴定

登革病毒包膜蛋白(Dengue virus envelope protein,DENV E)是诱导中和抗体主要的蛋白,登革病毒包膜蛋白Ⅲ区(Dengue virus envelope protein domainⅢ,DENV EDⅢ)是构建DENV亚单位疫苗的主要靶标,但是其B细胞中和表位目前了解不多。我们采用两组覆盖DENV-1EDⅢ的重叠多肽(12肽和16肽)同27株针对DENV-1EDⅢ中和单抗反应,筛选DENV EDⅢ上B细胞表位。采用该方法,我们发现了一高度保守的Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B细胞表位和一高度保守的DENV-1血清型特异性B细胞中和表位,分别位于DENV-1E蛋白氨基酸残基序列第309~320位和第381~392位(Amino acid residues 309~320,and 381~392;aa 309~320和381~392)。Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B细胞表位在Ⅰ～Ⅳ型DENV分离株中存在高度保守共同序列310 KEVAETQHGT319,DENV-1E蛋白中E309、V312、A313和V320不影响蛋白抗原性。DENV-1血清型特异性B细胞中和表位(DENV-1E蛋白氨aa 381~392)在DENV-1分离株中高度保守,在黄病毒属其它病毒中不保守。我们也发现一具有DENV-1分离株特异性的B细胞中和表位位于DENV-1E蛋白氨基酸残基序列第329~348位。这些新发现的DENV-1E蛋白EDⅢ上B细胞中和表位可能有助于研制新的DENV亚单位疫苗。     

登革病毒受体的研究进展

登革病毒(Dengue virus,DENV)是登革热(DF)、登革出血热和登革休克综合征(DHF/DSS)的病原体.根据包膜蛋白的抗原性的不同,DENV可分为4个血清型,即DENV1～4.由于血清型比较复杂,目前关于病毒受体仍未得出明确一致的结论.但近几年取得了一些引人注目的进展,比如研究发现甘露糖受体(MR)、CLEC5A等作为DENV的受体,可能在病毒进入宿主细胞过程中发挥重要作用.为此,就近几年关于DENV受体以及病毒进入细胞的机制作一综述.     

登革病毒诱导人单核细胞VEGF的表达及机制

研究登革病毒(Dengue virus,DENV)感染对人单核细胞中血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelialgrowth factor,VEGF)表达的影响,并检测分析可影响VEGF表达的天然免疫信号通路。通过Real-time PCR检测,发现不同型DENV(DENV1、DENV2、DENV3)感染THP-1细胞均可诱导VEGF mRNA表达水平呈时间依赖性增加;而DENV2感染也可上调VEGF在原代单核细胞中的表达。通过RNAi技术沉默Toll样受体3(TLR3)及接头蛋白IPS-1,发现DENV感染诱导的VEGF表达明显下调;而ERK、JNK及NF-κB等信号通路的抑制也可下调VEGF的表达水平。本研究证明,DENV感染可诱导人单核细胞中的VEGF高表达,而VEGF高表达依赖于TLR3及IPS-1信号通路的激活,提示VEGF可能是治疗登革出血热的一个靶点。     

登革病毒共有序列候选DNA疫苗的免疫原性和保护性研究

目的研究登革病毒(Dengue virus, DENV)共有序列候选DNA疫苗pVAX1-cE80在小鼠体内的免疫原性及其保护作用。方法首先利用pVAX1-cE80 DNA免疫BALB/c小鼠,通过ELISA和噬斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test, PRNT)分别检测免疫后小鼠血清中抗登革病毒的4种血清型(dengue virus serotype 1-4, DENV1-4)IgG抗体和中和抗体(neutralizing antibody, nAb)效价;利用酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT)检测小鼠脾细胞分泌DENV1-4特异性Th1/Th2型细胞因子的能力;通过攻毒试验评价疫苗对DENV1-4感染的保护作用。结果接种疫苗的小鼠可产生针对DENV1-4的四价抗体,其中抗DENV2抗体水平最高,IgG抗体和nAb效价分别为1∶1 086和1∶120;免疫后小鼠脾细胞在DENV1-4抗原刺激下均可分泌较高水平的IFN-γ和IL-4;疫苗免疫可为小鼠提供针对DENV1-4的部分保护作用。结论单一共有序列登革病毒候选DNA疫苗可诱导小鼠产生四价体液免疫反应和细胞免疫反应,并为小鼠提供部分保护作用,为登革病毒共有序列疫苗的研发奠定了基础。     

登革病毒交叉反应性单克隆抗体的制备及特异性研究

近年来全球登革疫情严峻,而针对登革疫苗的研究一直进展缓慢,尚无有效的疫苗或治疗性药物,被动免疫逐渐成为研究热点。本研究旨在通过制备登革病毒(Dengue virus,DENV)交叉反应性单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb)并鉴定其特异性,期望为登革病毒的被动免疫治疗及疫苗的研发提供一定的物质基础和参考。本研究采用4种DENV联合免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,采用有限稀释法对阳性孔细胞进行筛选,获得DENV交叉反应性mAb。采用腹水诱生法对其中的一株mAb进行了大量制备和纯化,鉴定其Ig亚类,通过间接法酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测了mAb对4种血清型DENV的有效滴度,通过间接免疫荧光试验(Immunofluorence assay,IFA)和蛋白质印迹(Western Blot,WB)对其特异性进行鉴定,通过噬斑减少中和试验(Plaque reduction neutralization test,PRNT)检测了mAb的中和能力。结果显示成功获得3株DENV交叉反应性mAb,分别为1G2、2F1、3G9。其中1G2株抗体的Ig亚类为IgG2b,纯化后抗体对DENV1～DENV4的有效滴度分别为1∶640、1∶640、1∶320、1∶320。IFA实验表明所获得的单抗1G2是针对DENV的特异性抗体,与黄热病毒(Yellow fever virus,YFV)、西尼罗河病毒(West Nile virus,WNV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)之间无交叉反应性;WB结果表明单抗1G2识别的目的蛋白是E蛋白(55～60kD)。PRNT结果表明单抗1G2对4种血清型DENV具有一定的中和活性,DENV1至DENV4的PRNT50分别为1∶80、1∶80、1∶80和1∶40。本研究成功筛选并鉴定到一株可交叉识别4种登革病毒E蛋白的mAb。     

登革2型病毒E蛋白结构域III的表达及多克隆抗体制备

登革病毒(Dengue virus,DENV)属于黄病毒科(Flaviviridae),黄病毒属(Flavivirus),为单股正链RNA病毒,有4个不同的血清型(DENV-1,2,3,4),主要通过埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)传播,可引起登革热、登革出血热、登革休克综合征等多种疾病[1,2]。E蛋白是位于DENV表面的结构蛋白,由495个氨基酸组成,它既含有黄病毒亚群特异的和登革病毒血清型特异的抗原表位,又有与中和,血凝抑制作用有关的抗原表位,是病毒颗粒的主要包膜蛋白[3]。Modis等研究表明,DENV-2型E蛋白以延伸的二聚体形式平铺在病毒表面,折叠成3个不…     

抗Ⅱ型登革病毒蛋白抗体的制备和特点分析

本研究旨在制备和鉴定小鼠抗Ⅱ型登革病毒（DENV‐2）10种蛋白的抗体,为后续相关研究提供实验材料。利用真核表达载体pReceiver构建DENV‐210种蛋白的重组质粒,提取质粒 DNA ,肌内注射免疫小鼠,共免疫4次。末次免疫后2周取小鼠血清,利用DENV‐2感染的Vero细胞和DENV‐2各蛋白的稳定表达细胞,通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光法（IFA）和蛋白免疫印迹法评价免疫效果,分析抗体的特点。DNA免疫小鼠后获得抗DENV‐210种蛋白的抗血清,抗体效价波动于1∶400～1∶16127之间,以抗E蛋白抗体效价最高,达1∶16127,而抗NS3、NS4b、NS5蛋白抗体效价较低,仅为1∶400。利用DENV‐2感染的Vero细胞和稳定表达病毒蛋白的EAhy926细胞进行IFA染色,抗DENV‐2各蛋白的抗血清均可特异性识别DENV‐2抗原。蛋白免疫印迹结果显示,抗E、NS1、NS4b和NS5蛋白抗体能识别热变性蛋白,其他抗血清未呈现阳性反应条带。本研究提示,DNA免疫小鼠所获得的抗DENV‐2各蛋白抗体能特异性识别自然感染或模拟自然感染状态下的DENV‐2蛋白,可为后续相关研究提供工具,也表明DNA免疫法可作为抗体制备的一种策略。     

登革病毒（DENV）基因组的5'和3'末端所蕴含的生物调控信息

登革病毒(Dengue virus,DENV)为正链RNA黄病毒,其基因组进入宿主细胞后经历了蛋白翻译和正链-负链-正链的RNA复制过程,病毒基因组的5'末端区域和3'末端区域的RNA序列和结构在上述过程中发挥不同的功能,病毒自身因此能更好地完成其生命活动。本文对DENV基因组末端区域各个序列和结构的基本功能,帽子结构依赖或非经典的非帽非IRES依赖的蛋白翻译,以环化为核心的5'–3'RNA长程相互作用的复制方式和3'UTR进化出的重复序列及串联结构在适应不同宿主所发挥的功能进行综述。     

登革病毒血清型特异单克隆抗体的制备和鉴定

登革病毒 (Dengue virus,DENV) 是全球传播最为广泛的虫媒病毒,由于缺乏快速鉴别感染病毒血清型的诊断技术,导致异型交叉感染引起重症登革出血热病例居高不下。为实现免疫学方法快速鉴别诊断不同血清型DENV感染,本研究采用哺乳动物细胞293T表达并纯化了4种DENV血清型NS1蛋白,免疫小鼠后通过杂交瘤技术制备了针对NS1蛋白的单克隆抗体。利用酶联免疫吸附方法 (Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、间接免疫荧光法 (Indirect immunofluorescence assay,IFA)、免疫斑点杂交试验 (Dot blotting) 以及蛋白质免疫印迹试验 (Western blotting) 确认所制备的单克隆抗体能够有效识别天然病毒NS1以及重组NS1蛋白。获得的单克隆抗体包含2株可识别1–4型DENV NS1蛋白的通用型抗体及3株分别针对DENV-1、DENV-2和DENV-4的血清型特异抗体。以所制备的DENV NS1抗体为基础,采用双抗体夹心ELISA可快速鉴别不同血清型DENV。DENV血清型特异单克隆抗体的制备和甄别DENV血清型ELISA方法的建立为快速鉴别感染DENV血清型的临床诊断奠定了基础。     

Ⅲ型登革病毒在THP-1细胞上的ADE模型建立

登革热(dengue fever,DF)是由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型登革病毒(dengue virus,DENV)引起的急性传染病,抗体依赖增强感染(antibody-dependent enhancement,ADE)是自限性的登革热以及危及生命的登革出血热(dengue hemorrhagic fever,DHF)或登革休克综合症(dengue shock syndrome,DSS)等重症的主要原因。采用不同稀释度的Ⅱ型登革病毒prM前膜抗体与分离自云南西双版纳重症病人的Ⅲ型登革病毒复合感染THP-1细胞,通过实时荧光定量PCR发现亚中和浓度prM前膜抗体诱发THP-1细胞液中更高浓度的病毒载量。在THP-1细胞系上的研究可为后续研究登革病毒ADE打下坚实的基础。     

登革病毒感染的检测技术研究进展

登革病毒(dengue virus,DENV)是引起登革热(dengue fever,DF)的病原体,经蚊叮咬而传播疾病.DF主要流行于热带和亚热带地区.目前,DF已经发展成一个日益严重的全球性公共卫生问题.2012年,DF被列为全球最重要的蚊虫传播性疾病.快速而准确的针对DENV感染的检测技术能够有效地控制DF的爆发及减少死亡病例.目前DENV感染的检测技术主要有病毒分离培养、分子生物学诊断及血清学诊断三类,三类检测技术各有优缺点,应该根据具体情况选用适当的检测手段.     

登革病毒感染HepG2-严重联合免疫缺陷小鼠模型的建立

缺乏合适的动物模型将严重限制登革病毒（DENV）致病机制研究的进展。本研究旨在构建DENV感染小鼠模型,为阐明其致病机制提供实验材料。首先在严重联合免疫缺陷（ SCID）小鼠腹腔内接种人肝癌细胞株HepG2,构建人鼠嵌合体动物模型;移植后10 d腹腔接种DENV,通过检测病毒在体内分布及主要器官的组织学改变,评价该动物模型的实用价值。结果显示,在SCID小鼠成功移植HepG2并感染DENV后,出现病毒血症及主要器官严重损伤等现象,但无后肢麻痹等人类登革热无关症状。本研究成功构建了SCID-HepG2人鼠嵌合模型,该模型能支持DENV复制,并表现出部分人类DENV感染的临床症状,为研究DENV的致病机制提供了有价值的实验材料。     

登革2型病毒E蛋白结构域Ⅲ的表达及多克隆抗体制备

登革病毒（Dengue virus,DENV）属于黄病毒科（Flaviviridae）,黄病毒属（Flavivirus）,为单股正链RNA病毒,有4个不同的血清型（DENV-1,2,3,4）,主要通过埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白纹伊蚊（Aedes albopictus）传播,可引起登革热、登革出血热、登革休克综合征等多种疾病。     

新型登革疫苗研究进展

登革病毒(Dengue virus,DENV)以伊蚊为主要传播媒介,可感染人,引起登革热(Dengue fever,DF)、登革出血热(Dengue hemorrhagic fever,DHF)及登革休克综合征(Dengue shock syndrome,DSS),其中以登革热最常见,广泛流行于热带和亚     

DC-SIGN与病原感染

DC-SIGN是相对限制地表达于树突细胞上的膜分子,能结合人类免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒和Ebola病毒等,并且介导这些病毒在体内的感染,在病毒致病中发挥重要作用;同时它还可以作为ICAM-2、ICAM-3的受体,介导树突细胞在体内的转运和免疫突触的形成;最后,它还可以作为抗原识别受体,参与抗原呈递。最近报道,无鞭毛体利什曼原虫、登革病毒、结核分枝杆菌也能结合人类树突细胞DC-SIGN或DC-SIGN转染的细胞,进一步确立了DC-SIGN在树突细胞介导免疫反应中的关键作用。     

表达登革病毒prM基因小干扰RNA的Vero细胞系的建立

prM蛋白是登革病毒膜蛋白M的前体,膜蛋白M对病毒的组装与成熟有重要作用,针对prM基因设计的小干扰RNA（siRNA）可短期抑制登革病毒复制.为了达到长期抑制登革病毒的效果,本研究构建了插入prM siRNA序列的重组慢病毒,利用流式细胞术分选以及杀稻瘟霉素抗性,筛选出稳定表达prM siRNA的非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）系.经逆转录PCR及测序验证siRNA序列表达正确. Vero细胞中prM siRNA的表达率约为976%.当受到登革病毒攻击时,表达prM siRNA的Vero细胞能够明显抑制登革病毒prM基因的表达,并抑制登革病毒在Vero细胞中的复制.建立的Vero细胞系可用于RNA干扰防治登革病毒感染的进一步应用研究.     

登革2型病毒E蛋白结构域Ⅲ的表达及多克隆抗体制备

登革病毒(Dengue virus, DENV)属于黄病毒科(Flaviviridae),黄病毒属(Flavivirus),为单股正链RNA病毒,有4个不同的血清型(DENV- 1,2,3,4),主要通过埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)传播,可引起登革热、登革出血热、登革休克综合征等多种疾病 [1,2].     

47kD尾连蛋白在病毒感染过程中的作用

47kD尾连蛋白(tail interacting protein of 47kD, TIP47)是PAT蛋白家族成员,主要定位于脂滴(lipid droplets, LDs)表面及细胞质中,参与脂质代谢调节及病毒复制、转运、组装、释放过程,而且人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)和登革病毒(dengue virus, DENV)等多种病毒感染与此过程密切相关。现就目前TIP47在HIV、HCV、DENV等多种病毒感染中所起的作用作一概述,旨在为抗病毒治疗及疫苗研制提供新的思路与途径。     

新型登革疫苗研究进展

登革病毒(Dengue virus,DENV)以伊蚊为主要传播媒介,可感染人,引起登革热(Dengue fever,DF)、登革出血热(Dengue hemorrhagic fever,DHF)及登革休克综合征(Dengue shock syndrome,DSS),其中以登革热最常见,广泛流行于热带和亚     

登革病毒四型联合重组包膜蛋白Ⅲ区的表达和免疫原性鉴定

登革热在全球范围内广泛流行,但是目前为止却仍然没有疫苗上市,疫苗的开发迫在眉睫。抗体依赖增强感染效应是登革病毒疫苗开发中遇到的一个瓶颈问题。研究表明登革病毒的包膜蛋白Ⅲ区能够介导中和抗体产生,且诱导产生较少的交叉抗体或无交叉抗体,能够大大减弱抗体依赖增强感染效应,因而是登革热重组蛋白疫苗的首选靶标。通过酵母密码子优化后合成同时包含4种血清型登革病毒包膜蛋白Ⅲ区的四价联合DV EDⅢ蛋白序列,随后构建酵母表达质粒,并获得酵母表达菌株,经诱导后四联DV EDⅢ蛋白获得高效表达。通过Western blot、ELISA检测及蛋白质免疫原性鉴定,结果表明登革病毒四联DV EDⅢ蛋白表达质粒构建成功,重组蛋白在毕赤酵母获得高效表达,免疫小鼠后能够介导产生较高水平的血清效价。这表明已获得了能引起有效免疫反应的四型登革病毒EDⅢ蛋白,为登革病毒疫苗的研究提供了良好的基础。