共查询到19条相似文献,搜索用时 171 毫秒
1.
通过对东亚三角涡虫胰蛋白酶Djtry氨基酸序列比对分析,发现保守的催化三联体结构中第一位的His被Lys所取代。为了探究这种突变是否会对胰蛋白酶的活性有影响,文章构建了原核表达重组质粒pET-28a-Djtry,转化到E.coli BL21中,利用IPTG诱导表达,对表达的重组蛋白进行变性、复性、纯化以及Westernblotting鉴定,获得成分均一的活性蛋白。利用牛胰蛋白酶为标准品,胰蛋白酶特异性底物BAEE,检测Djtry酶活力与比活力。SDS-PAGE电泳表明诱导表达的融合蛋白为包涵体,分子量约为26 kDa,Western blotting结果显示为目的蛋白,对复性纯化的目的蛋白进行酶活检测发现,突变型胰蛋白酶Djtry仍然保持了胰蛋白酶催化性质,但是催化活性相对较弱。 相似文献
2.
探索以包涵体形式表达的重组蛋氨酸裂解酶的纯化、复性方法,并对其活性进行检测。将阴道毛滴虫蛋氨酸裂解酶重组表达载体PET-15b-mgl1转化大肠杆菌BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,并对表达条件进行优化,获得大量表达。通过对包涵体的纯化及复性研究,检测重组蛋氨酸裂解酶的免疫活性及酶活性。Western blotting结果表明,重组蛋氨酸裂解酶免疫小鼠制备的多抗可以和从阴道毛滴虫中提取的天然蛋氨酸裂解酶发生特异性反应。活性检测结果显示复性蛋氨酸裂解酶有活性,复性效率达到25%左右。以包涵体形式表达的蛋氨酸裂解酶经变性、纯化及复性后,获得大量有活性的酶,为深入了解其结构、功能及酶学性质,开展其在临床检测中的应用研究奠定基础。 相似文献
3.
目的:在大肠杆菌中表达1型单纯疱疹病毒(HSV-1)囊膜糖蛋白gD,纯化重组蛋白并对其免疫活性进行鉴定。方法:将HSV-1 gD 基因克隆入原核表达载体pET-28b,利用异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组质粒转化的大肠杆菌,探讨IPTG浓度、诱导时间、诱导温度对重组蛋白表达的影响;盐酸胍裂解变性包涵体,镍柱亲和层析法纯化gD蛋白,并对纯化后的蛋白进行透析复性;Western blot和ELISA检测gD蛋白的免疫活性。结果:酶切和测序结果表明gD基因克隆入pET-28b载体。该重组质粒转化的大肠杆菌经IPTG诱导后重组蛋白主要以包涵体形式存在,大小约40kDa。gD蛋白诱导表达的最佳条件为0.5mmol/L IPTG于37℃诱导8h。镍柱亲和层析法纯化获得的gD蛋白总量为3.1mg/L,透析复性后获得的gD蛋白总量为1.3mg/L,复性率为41.37%。Western blot及ELISA检测表明表达的gD蛋白具有免疫活性。结论:在大肠杆菌中表达并纯化获得具有免疫活性的HSV-1 gD蛋白,为进一步制备HSV-1诊断试剂和预防疫苗奠定了基础。 相似文献
4.
目的:构建、表达重组猪源胰蛋白酶原,并对其进行分离纯化和酶活性分析。方法:利用大肠埃希菌表达系统(pET-28a,宿主菌BL21 DE3)优化天然猪源胰蛋白酶原基因,经乳糖诱导表达重组胰蛋白酶原蛋白,采用阴离子交换色谱法分离纯化,以SDS-PAGE 电泳鉴定目标蛋白,以紫外分光光度法检测重组蛋白的酶活力。结果:测序结果表明,重组猪源胰蛋白酶原基因工程菌构建成功,SDS-PAGE检测显示目的蛋白条带位置与标准猪源胰蛋白酶条带位置一致,且酶活力可达513.09 U?mg-1。结论:成功获得了重组猪源胰蛋白酶原,且酶活力较好,为进一步研究生产提供了基础。 相似文献
5.
6.
为获得可溶性高纯度HIV-1中国株CN54PolP51抗原,将携带CN54polp51基因的重组质粒pTHioHisA51转化大肠杆菌BL21codonplus-RIL,用IPTG进行诱导表达。用Chelating SepharoseFF-Ni亲和层析柱及DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱纯化目的蛋白,采用透析复性法得到可溶性抗原,Western blotting检测目的蛋白。用纯化的P51抗原蛋白标记辣根过氧化物酶及包被酶标板进行双抗原夹心法ELISA检测。结果显示P51以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的50%,经两步层析和透析复性,目的蛋白纯度大于95%。Western blotting和双抗原夹心法ELISA检测均显示了良好的灵敏度和特异性。本研究可以为HIV-1疫苗研究和开发检测试剂提供支持。 相似文献
7.
目的:利用基因工程方法构建人源性脂联素球状结构(gAd)基因的高效原核表达体系,并对重组蛋白进行诱导表达、纯化、鉴定及活性检测.方法:从正常人脂肪组织里面提取总RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒pET-22b(+)-gAd,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞.经诱导剂诱导后目的蛋白以包涵体形式产生,采用强碱促溶包涵体并用丙酮沉淀蛋白的方法进行复性和纯化,得到高纯度的人源性gAd.运用SDS-PAGE、Western blotting对重组蛋白进行鉴定,通过对蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用来检测纯化蛋白的生物学活性.结果:成功构建了原核表达载体pET-22b(+)-gAd,实现了人源性gAd在原核细胞中的表达,并对形成的包涵体变性、复性和纯化,纯化出的蛋白经过SDS-PAGE和Western分析证实为gAd;通过对AMPK的磷酸化水平的检测和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用证明纯化出的gAd具有高生物学活性.结论:成功构建、表达和纯化了无标签、高生物学活性的人源性脂联素球状结构(gAd),为其进一步的理论研究、生产开发奠定了基础. 相似文献
8.
为研究牙鲆甲状腺激素受体TRαA在牙鲆变态发育过程中的调控作用,将TRαA基因克隆插入融合表达栽体pET30a,并在大肠杆菌Escherichia coli DE3(BL21)中进行诱导表达.表达菌株经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h后,重组蛋白TRaA表达并形成包涵体.SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物.包涵体经变性后在His-Bind树脂进行亲和层析纯化,柱上复性法对重组蛋白复性,获得纯度较高的目的蛋白,蛋白复性的效果良好.用纯化后的目的蛋白免疫新西兰家兔制备多克隆抗体.Dot blotting检测抗体效价达1:200 000,检测证明抗体特异性良好.此外,通过染色质免疫沉淀技术鉴定了在活体细胞中多克隆抗体与TRαA的特异性结合.表明了甲状腺激素通过其受体在体内参与碱性磷酸酶(ALP)基因的转录调控. 相似文献
9.
目的:重组表达抗PAI抑制作用的t-PA突变体,经诱导表达、复性、纯化后进行生物学活性和酶动力学分析。方法:构建pBV220-tpa重组表达质粒,经DNA测序确认后,转化至大肠杆菌DH5a,温控诱导表达,凝胶过滤法对包涵体蛋白进行初步纯化,复性后,过刺桐胰蛋白酶亲和层析柱纯化,酶动力学分析其活性。结果:测序证实,t-PA突变体的DNA序列正确,表达蛋白占总菌体蛋白的30%,经纯化后纯度达90%以上,比活性为7.0×108IU/mg,t-PA突变体与PAI-1反应后,其活性未受到抑制。t-PA突变体酶的米氏常数Km为0.5298,最大水解速度Vmax为0.0595。结论:经生物学活性测定,表达蛋白能够明显抵抗PAI的抑制作用,并具有良好的生物活性,该突变体有可能成为用量更少、疗效更佳的新型溶栓药物。 相似文献
10.
本研究报道了猪尿酸氧化酶(Porcine urate oxidase,pUOX)的原核表达载体的构建、pUOX的蛋白表达条件的优化以及对pUOX经纯化后进行活性检测和酶学性质分析。利用RT-PCR从猪肝总RNA中克隆pUOX,定向插入原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET30a(+)/pUOX,并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中。重组质粒pET30a(+)/pUOX经双酶切鉴定和序列分析,证实已成功构建了重组表达载体。重组表达菌经IPTG诱导表达了约为41kD的蛋白,与预期分子量一致,并对pUOX蛋白表达条件进行了优化,表达的蛋白主要以包涵体的形式存在于细胞中,包涵体经过变性、复性后,用Ni2+-NTA对复性蛋白进行亲和纯化,并对纯化蛋白进行了活性检测和酶学性质分析,纯化的重组pUOX的比活为50.63IU/mg,并发现重组蛋白在最佳温度、热稳定性等方面与天然pUOX相同,为后续动物实验奠定重要的基础。 相似文献
11.
Angioarrestin是一种具有潜在应用价值的肿瘤血管形成抑制因子.利用DNA重组法构建了angioarrestin C端 hFD cDNA 和麦芽糖结合蛋白(MBP)重组原核表达质粒 pMAL-C2-hFD.将重组质粒转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3),经0.3 mmol/LIPTG 在37℃条件下诱导表达4h,SDS-PAGE 检测,融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的20%.Western印迹证实,目的蛋白N端带有MBP标签.取表达上清纯化、透析、浓缩并冻干,以此为抗原免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体.此多抗可以与pET 22b(+)表达系统获得的 hFD重组蛋白发生良好的抗原抗体反应,ELISA检测多抗效价达1∶10240.实验证明:通过基因重组可获得angioarrestin C端hFD在大肠杆菌中的高效表达蛋白,且该蛋白具有较高的免疫活性.以此为抗原制备的抗angioarrestin多克隆抗体为深入研究angioarrestin提供了材料. 相似文献
12.
将狂犬病病毒中和性单链抗体基因克隆入原核表达载体pET-PE40,经酶切鉴定及序列测定,成功构建了重组免疫毒素原核表达载体。IPTG诱导后目的蛋白获得高效表达,SDS-PAGE分析目的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于菌体中,表达量占菌体总蛋白的32.29%。包涵体蛋白经体外复性及离子交换色谱柱、疏水作用色谱柱、Sephadex G200凝胶过滤层析柱三步纯化后获得纯度大于96%的目的蛋白,间接免疫荧光染色检测表明重组免疫毒素与狂犬病病毒感染细胞具有抗原结合活性,MTT试验显示,重组免疫毒素对狂犬病病毒感染细胞具有明显的杀伤作用,而对正常细胞无杀伤作用。 相似文献
13.
家蚕天蚕素cDNA原核表达及抗菌活性检测 总被引:5,自引:1,他引:4
采用RT-PCR方法从家蚕Bombyx mori新疆品种新蚕三号组织中扩增天蚕素cDNA片段,回收并克隆至Pmd18-T载体,进行序列分析。基因序列分析结果与已发表的天蚕素B的序列同源性为98%,表明所克隆的新疆家蚕天蚕素cDNA为独特的cDNA片段。将天蚕素基因与Pgex-4T-1融合表达载体中的谷胱甘肽转移酶基因融合,在大肠杆菌中表达, 结果表明经IPTG 诱导30 min后,pGEX-4T-1/天蚕素转化后的大肠杆菌生长明显受到抑制;当诱导210 min 后,大肠杆菌数量又开始增加,逐渐恢复至正常水平。说明天蚕素与谷胱甘肽转移酶基因融合表达后,在IPTG存在的短时间内仍然对原核细胞有较强的抗菌抑杀作用。 相似文献
14.
青鱼生长激素的重组表达及其多克隆抗体的制备 总被引:2,自引:0,他引:2
以含有的青鱼生长激素编码区cDNA的重组质粒pbcGHc为模板,高保真PCR扩增青鱼生长激素(GH)成熟肽cDNA序列,定向插入原核表达载体pET-28a,构建青鱼GH原核表达质粒pET-bcGH。将pET-bcGH转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导青鱼GH基因在大肠杆菌中的融合表达,SDS-PAGE凝胶电泳结果显示一条23 kDa的诱导表达重组青鱼GH带。以草鱼GH多克隆抗体为一抗,Western Blot证明,该重组青鱼GH具有免疫学活性。将经过亲和层析、透析纯化后的重组青鱼GH作为抗原,采用改进的方法对家兔进行皮下免疫注射,获得青鱼GH多克隆抗血清。以该多抗为一抗,Western Blot 可以检测出4 ng的抗原量;并且在青鱼垂体组织抽提液中和血清中检测到一种能与该抗血清作用的大小为21 kDa的蛋白质。这些结果表明本研究得到的青鱼GH多克隆抗血清具有较好的免疫特性。 相似文献
15.
A trypsin-streptavidin (TRYPSA) fusion protein was designed and its expression in Escherichia coli was evaluated. The streptavidin gene was PCR modified and cloned into the pET expression vector. The trypsin gene was subsequently inserted into this plasmid, thus generating a colinear fusion of trypsin and streptavidin genes (pTRYPSA). This engineering strategy was verified, and TRYPSA was expressed after IPTG induction using the E. coli strains, BL21(DE3) and BL21(DE3)pLysS. Standard protein fractions of the cell lysate were prepared and trypsin activity was primarily detected in the periplasmic and inclusion body fractions. Immunoblotting showed a single Western-positive band exhibiting a molecular weight of 39,000 Da. A biotinylated porous glass affinity matrix was prepared and selective adsorption resulted in a one-step purification and immobilization of TRYPSA from crude cell lysate. Trypsin activity was verified using a synthetic substrate. This enzyme bioreactor should serve as an excellent prototype for future studies that will examine the effect of limited proteolysis on functional characteristics of milk proteins, including gelling, emulsifying and foaming properties. 相似文献
16.
17.
TALF(Tachyleus antilipoposaccharide factor)对细菌内毒素(LPS)的核心部分有抑制作用。研究TALF cDNA基因在大肠杆菌中的表达,首先将TALF cDNA基因分别插入大肠杆菌表达载体pGEX-4T-2、pET22b、pET28a中,构建重组表达质粒,转化于大肠杆菌BL21(DE3)。结果表明克隆于pET22b、pET28a中的TALF cDNA基因没有表达,而融合了GST的TALF基因(GST-TALF)能够在大肠杆菌中表达,并形成包涵体。从1L培养基中可获得4mg纯度为91%的GST-TALF融合蛋白。经复性和纯化后的融合蛋白GST-TALF几乎检测不到抑菌活性及LPS中和活性,但该融合蛋白经凝血酶消化后表现出明显的体外抑菌活性及LPS中和活性。 相似文献
18.
载脂蛋白E(apolipoproteinE ,apoE)由 2 99个氨基酸组成 ,分子量 34kD ,是维持人体正常脂质代谢的必需蛋白质 .它是乳糜微粒 (CM )、极低密度脂蛋白 (VLDL)和高密度脂蛋白 (HDL)的组分 ,是极低密度脂蛋白受体的重要配体 ,是脂质进入细胞不可缺少的中介 .apoE有 3种同分异构体 :apoE2、apoE3、apoE4 ,分别具有不同的生理作用 .apoE4与血浆高胆固醇、心血管疾病和老年痴呆等疾病关联[1~ 3 ] .apoE2与Ⅲ型高脂血症有关 ,并对老年痴呆有防治作用[4,5] .apoE3是大多数健康人所具有… 相似文献
19.
首次从麻疯树胚乳cDNA丈库中克隆得到一个RJNG型锌指蛋白基(GenBank登录号为JF920726),命名为JcRFP1。该cDNA长度为728bp,包含编码JcRFP1蛋白的完整开放阅读框(516bp)。脚,基因在麻疯树各器官中均检测到表达且表达量依次为:叶〉茎〉花〉果实〉种子〉根。将克隆到的JcRFP1基因的cDNA序列连接到表达载体pET32a(+)上,导入BL21(DE3)pLysS菌株,成功诱导表达相对分子质量为33.2kDa的可溶性融合蛋白。该融合蛋白免疫新西兰大白兔,得到效价为1:6500的抗血清。研究表明,JcRFP1蛋白具有体外泛素连接酶E3活性,在麻疯树体内可能参与油菜素甾醇信号转导途径。 相似文献