耐辐射球菌基因DRB0099缺失突变株的构建及逆境分析

耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans R1)有着极强的辐射抗性.研究其抗辐射的机理对于处理放射性废料有着潜在的应用价值.在耐辐射球菌的基因组中,许多序列的功能未知.其中DRB0099尤为引人注意.将DRB0099缺失突变构建该基因的突变株.对野生型和突变体进行比较后发现,在正常生长条件下的前期阶段(0～16 h),突变体生长速度比野生型慢.16 h以后,野生型逐渐进入稳定生长期.这时,突变株的生长速度高于野生型.但是,野生型的浓度一直高于突变株.表明在DRB0099被删除后,耐辐射球菌的生长可能受到了阻滞.在紫外线照射的条件下,尽管野生型随着照射剂量的增加,存活率越来越低,但是要比突变体高许多.野生型具有比突变体更强的修复DNA双链断裂的能力.DRB0099可能直接参与了对DNA的修复.突变体对H2O2的敏感程度高于野生型,表明野生型耐辐射球菌在对抗活性氧保护其蛋白质、DNA或者DNA修复方面具有比突变体更强的功能.在低浓度H2O2处理条件下,尽管野生型和突变体的存活率都出现下降趋势,但二者的差值并不大.随着H2O2剂量的增加,二者的差值越来越大.表明随着活性氧浓度的增加,蛋白质和DNA损伤的数量增加,失去DRB0099基因功能的突变体比野生型更容易受到损伤.在紫外线照射处理或者H2O2处理条件下,DRB0099能够保护蛋白质和DNA.     

耐辐射奇球菌crtI基因缺失突变株的构建及其功能研究

利用PCR方法和体内同源重组技术,对耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)中控制色素合成的关键基因———crtI进行缺失突变,成功获得红色色素缺失突变株M61。对突变株分别进行不同剂量电离辐射(IR)和不同浓度过氧化氢(H2O2)处理,结果表明:与野生型菌株R1相比,突变株M61对电离辐射的抗性降低;对过氧化氢的敏感性明显上升,在高浓度H2O2条件下表现异常敏感。HPLC分析结果显示,crtI基因的完全缺失对色素合成途径产生重要影响,导致番茄红素和其他红色类胡萝卜素的合成被抑制。证明crtI基因是耐辐射奇球菌中控制红色类胡萝卜素合成的一个关键基因。为阐明耐辐射奇球菌中类胡萝卜素参与的抗辐射和抗氧化机制奠定了一定基础,为进一步研究类胡萝卜素在耐辐射奇球菌中的合成途径及功能提供了思路。     

耐辐射奇球菌crtⅠ基因缺失突变株的构建及其功能研究

利用PCR方法和体内同源重组技术,对耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)中控制色素合成的关键基因--crtⅠ进行缺失突变,成功获得红色色素缺失突变株M61.对突变株分别进行不同剂量电离辐射(IR)和不同浓度过氧化氢(H2O2)处理,结果表明与野生型菌株R1相比,突变株M61对电离辐射的抗性降低;对过氧化氢的敏感性明显上升,在高浓度H2O2条件下表现异常敏感.HPLC分析结果显示,crtⅠ基因的完全缺失对色素合成途径产生重要影响,导致番茄红素和其他红色类胡萝卜素的合成被抑制.证明crtⅠ基因是耐辐射奇球菌中控制红色类胡萝卜素合成的一个关键基因.为阐明耐辐射奇球菌中类胡萝卜素参与的抗辐射和抗氧化机制奠定了一定基础,为进一步研究类胡萝卜素在耐辐射奇球菌中的合成途径及功能提供了思路.     

耐辐射奇球菌dps突变株的构建和蛋白功能初步研究

Dps(DNAprotection during starvation)蛋白是原核生物中特有的一类具有铁离子结合和抗氧化损伤功能的重要蛋白。利用体外PCR扩增技术和体内同源重组方法,获得了耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)dps全基因(DRB0092)缺失突变株。对突变株和野生型分别进行不同浓度过氧化氢(H2O2)处理,结果表明:与野生型菌株R1相比,dps突变株在低浓度H2O2(≤10mmol/L)条件下存活率急剧下降,而高浓度(≥30mmol/L)下则完全致死。Native-PAGE活性染色结果显示,稳定生长期dps突变株体内两种过氧化氢酶(KatA和KatB)的活性较野生型R1分别上调2.3倍和2.6倍。通过质粒构建和大肠杆菌诱导表达,获得可溶性Dps蛋白。体外结合和DNA保护实验结果显示:Dps具有明显的DNA结合功能,并能保护质粒DNA免受羟自由基攻击。本研究证明,Dps蛋白在耐辐射奇球菌抗氧化体系中发挥重要作用,可能对该菌极端抗性机制有重要贡献。     

耐辐射动球菌耐辐射及相关特性研究进展

核能的利用对于缓解能源紧张、减少温室气体排放具有重要意义,然而核能利用产生的放射性废料对环境的影响成为核能发展的掣肘。耐辐射动球菌(Kineococcus radiotolerans)是一种从核污染环境中分离出来的,可在辐射、强碱、高盐、干旱、高金属离子浓度、高渗透压及强化学毒性等严酷环境中存活的革兰氏阳性耐辐射菌,有望应用于环境生物修复、医学等领域。本文就K.radiotolerans的生理生化特性、抗辐射性、抗氧化性、抗毒性有机物等特性的研究现状进行综述。     

耐辐射奇球菌dps突变株的构建和蛋白功能初步研究

Dps(DNAprotection during starvation)蛋白是原核生物中特有的一类具有铁离子结合和抗氧化损伤功能的重要蛋白。利用体外PCR扩增技术和体内同源重组方法,获得了耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)dps全基因(DRB0092)缺失突变株。对突变株和野生型分别进行不同浓度过氧化氢(H₂O₂)处理,结果表明:与野生型菌株R1相比,dps突变株在低浓度H₂O₂(≤10mmol/L)条件下存活率急剧下降,而高浓度(≥30mmol/L)下则完全致死。Native-PAGE活性染色结果显示,稳定生长期dps突变株体内两种过氧化氢酶(KatA和KatB)的活性较野生型R1分别上调2.3倍和2.6倍。通过质粒构建和大肠杆菌诱导表达,获得可溶性Dps蛋白。体外结合和DNA保护实验结果显示:Dps具有明显的DNA结合功能,并能保护质粒DNA免受羟自由基攻击。本研究证明,Dps蛋白在耐辐射奇球菌抗氧化体系中发挥重要作用,可能对该菌极端抗性机制有重要贡献。     

耐辐射球菌基因DR1709与DR2523的突变分析

摘要：【目的】检测在耐辐射球菌抵抗外来辐射和氧自由基的过程中,锰离子转运蛋白基因（DR1709和DR2523）是否发挥了作用。探讨锰离子、锰离子转运蛋白基因与耐辐射球菌辐射抗性之间的关系。【方法】分别构建这两个基因的突变体。对突变体和野生型进行紫外线照射和过氧化氢处理。对处理后的菌株存活率进行分析。【结果】DR2523被突变以后,耐辐射球菌在tryptone-glucose-yeast extract (TGY)培养液中的生长受影响很小。而DR1709突变体M1709在对数生长阶段的生长速度远低于野生型。     

耐辐射球菌RNA聚合酶β亚基突变对基因表达全局的影响

RNA聚合酶的B亚基参与与利福平的结合,并在原核生物中高度保守．许多细菌中利福平耐药株的rpoB基因均有氨基酸改变．本实验室曾分离2两株耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans）自发突变利福平耐药株（突变为：L420R和1258—669-bp缺失）．本研究发现,β亚基的变化对生长速度有独特的效果．利用DNA芯片技术和生化分析鉴定耐辐射球菌的利福平突变株如何调控基因表达改变生长速度的分子机制．参与代谢、细胞进程和信号传递以及信息贮存和处理的基因的转录在9bp缺失突变株中显著改变．9bp缺失突变株的上调基因的共有启动子序列为富含AT的序列．与野生株相比,L420R和9bp缺失突变株积聚了更多的活性自由基．这些结果初步探讨了D亚基突变调控基因的表达机制．     

辐射过程中耐辐射奇球菌蛋白酶变化的检测与分析

采用明胶和酪蛋白底物酶谱法以及荧光酪蛋白底物对紫外线以及γ射线辐射后恢复期耐辐射奇球菌R1(Deinococcus radiodurans R1,DRR1)的蛋白酶变化进行了检测。结果发现,DRR1存在高活性大分子量组成性表达蛋白酶,与Karlin等［16］提出的DRR1蛋白酶为预测高表达蛋白(PHX)的设想一致。DRR1包含大量分子量大于140kD 的明胶降解酶和分子量大于120kD的酪蛋白降解酶,其中活性最高的174kD明胶酶在经SDS变性处理后仍有较高活性,该蛋白酶在DRR1受紫外线辐射和电离辐射后恢复期的表达模式存在差异,在γ射线电离辐射过程中以及电离辐射后恢复的晚期活性较高。此外,还发现一些蛋白酶特异性由辐射所诱导,表明这些蛋白酶可能参与细胞信号通路中蛋白的顺序降解,也提示DRR1损伤修复过程中细胞内存在一个精确的蛋白酶系统。这些蛋白酶的表达与细胞的营养状态相关。同时对一株由本实验室从北京地区土壤中分离到的杆状耐辐射菌RR533.2的明胶和酪蛋白蛋白酶谱进行了测定,结果发现其蛋白酶谱与DRR1相类似。     

一株新的耐辐射菌Deinococcus guangxiensis sp.nov.的分离鉴定及耐辐射特性分析

摘要：【目的】从广西大学辐射中心辐射源附近被常年辐射的水样中分离并鉴定出新的耐辐射菌株,并对其耐辐射特性进行研究。【方法】通过GBM培养基分离培养得到一株新的耐辐射菌株,命名为WGR700T。应用生理生化试验,脂肪酸含量,(G+C) mol％含量测定以及16S rRNA序列同源性分析等方法对菌株进行鉴定,同时对WGR700T的耐辐射特性进行分析。【结果】菌株WGR700T为革兰氏阴性,杆状,没有鞭毛,不能运动,厌氧并能产生红色素。最佳生长温度和PH分别为37℃和pH7.0,主要的呼吸醌是MK-8,细胞壁内还有鸟氨酸,主要脂肪酸为16:1ω7c, 16:0, 15:1ω6c, iso-15:0和 iso-17:0。G+C含量为64.7mol%。菌株WGR700T具有很强的UV(>728 J/m2)和电离辐射抗性(D10 = 9.8 kGy)。菌株WGR700T和奇异球菌属（Deinococcus）内其它菌种16S rRNA有很高的相似性（87.1-95.6%）。【结论】根据16S rRNA及生理生化特征区别,菌株WGR700T应是奇异球菌属的一个新种,命名为Deinococcus guangxiensis sp. nov. 模式菌株为WGR700T(= CGMCC1.7045T =CICC 10360T = JCM 15082T)。     

Role of RecA in DNA damage repair in Deinococcus radiodurans

It has been shown previously that the RecA protein of Deinococcus radiodurans plays a unique role in the repair of DNA damage in this highly DNA damage-resistant organism. Despite the high level of amino-acid identity, previous work has shown that Escherichia coli RecA does not complement D. radiodurans RecA mutants, further suggesting the uniqueness of D. radiodurans RecA. The work presented here shows that E. coli RecA does in fact provide partial complementation to a D. radiodurans RecA null mutant, suggesting that the RecA protein from D. radiodurans may not be as unique as believed previously.     

单亲灭活柠檬酸杆菌与奇球菌原生质体融合

利用单亲灭活原生质体技术对柠檬酸杆菌和奇球菌原生质体进行了融合,考察了原生质体制备条件与融合中的影响因素。试验表明,随着溶菌酶浓度,酶解时间的增加和温度的上升,原生质体的形成率呈上升趋势,而再生率则逐渐下降。另外,正交试验结果表明,在PEG(6000)浓度40%、融合时间10min、融合温度42°C、pH值为8的条件下促融,最大融合频率可达2.74×10-7。筛选出来的融合子传代10次,性状稳定。进一步研究发现融合子在铀溶度为85mg/L时,比柠檬酸杆菌耐受性好;融合子和亲本吸附比较试验中,融合子总体吸附性能比柠檬酸杆菌略高。研究结果为耐辐射基因工程菌的构建提供了基础。     

D.radiodurans CatB基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

通过生物信息学方法从耐辐射奇球菌（Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）全基因组居库中查鼠并克隆了编码过氧化氢酶（Ｃａｒｔａｌａｓｅ,Ｃａｔ）的１６１１ｂｐ长ＣａｔＢ基因,将ＣａｔＢ基因连人ｐＫＫ２２３－３表达载体,转化Ｃａｔ酶链陷型大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＵＭ２）。转化菌裂解液ＰＡＧＥ酶活性染色分析实物具有Ｃａｔ酶活性,电泳过移位置与ＣａｔＢ位置相符。Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ ＣａｔＢ基因的表达可使Ｅ．     

离子注入对耐辐射微球菌存活及生物量的影响

以耐辐射异常微球菌（Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）为试材,研究了离子注入对其存活和生物干重的影响。结果表明,不同能量和不同种类的离子注入Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ,其存活均表现为先降后升再降的变化,即存活曲线呈现为相似的“马鞍型”,只是在不同种类的离子注入中,注入能量为２０ｋｅＶ的原子质量较大的Ｎ＋离子比Ｈ＋对其存活和生物干重的影响较大;在不同能量的离子注入中,能量相对较高的３０ｋｅＶ的Ｎ＋离子注入比２０ｋｅＶ的影响大。离子注入生物体产生这种不同于其它电离辐射的存活规律,意味着其对生物体的作用机理显著不同于其它电离辐射。     

非生物胁迫下耐辐射异常球菌drB0118基因功能分析

【目的】鉴定和确定被预测为编码干燥相关蛋白的耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans) drB0118基因功能,探讨该基因对盐、渗透和氧化胁迫抗性的作用。【方法】构建drB0118基因缺失突变株(ΔB0118),通过氯化钠、D-山梨糖醇和过氧化氢等胁迫冲击实验及氧化胁迫条件下qRT-PCR分析,研究drB0118突变对非生物胁迫反应及氧化胁迫相关基因表达的影响。【结果】drB0118突变导致菌株对NaCl和D-sorbitol胁迫的抗性降低;对氧化胁迫(H2O2)敏感;qRT-PCR分析显示,drB0118突变引起氧化胁迫抗性基因pod和oxyR分别下调4倍和10倍。【结论】D. radiodurans中drB0118参与了盐、渗透和氧化等多种非生物胁迫反应。