以SecA为靶点的新型抗绿脓杆菌药物细胞水平筛选模型的建立和应用

Sec途径(即分泌途径secretion pathway)是蛋白质转运的主要途径.其中,最为关键的组分之一是SecAATP酶,是蛋白质转运途径中的"动力泵",通过ATP的水解循环驱使蛋白质前体穿过细菌内膜,在细菌中是不可缺少的.我们推测抑制SecAATP酶活性的化合物.必然会在一定程度上抑制蛋白质的转运和分泌.通过绿脓杆菌与大肠杆菌SecA蛋白的互补作用,利用本实验室构建的高效表达SecA蛋白的基因工程菌,建立了SecA蛋白ATP酶活性抑制剂的细胞水平筛选模型.利用所纯化的绿脓杆菌SecA蛋白的ATP酶活测定体系,验证了所建立的细胞水平筛选模型具有一定的特异性.研究结果表明其中两个酯相组分在细胞水平和蛋白水平均具有活性,值得进行深入的研究.     

抗Ⅱ型登革病毒蛋白抗体的制备和特点分析

本研究旨在制备和鉴定小鼠抗Ⅱ型登革病毒（DENV‐2）10种蛋白的抗体,为后续相关研究提供实验材料。利用真核表达载体pReceiver构建DENV‐210种蛋白的重组质粒,提取质粒 DNA ,肌内注射免疫小鼠,共免疫4次。末次免疫后2周取小鼠血清,利用DENV‐2感染的Vero细胞和DENV‐2各蛋白的稳定表达细胞,通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光法（IFA）和蛋白免疫印迹法评价免疫效果,分析抗体的特点。DNA免疫小鼠后获得抗DENV‐210种蛋白的抗血清,抗体效价波动于1∶400～1∶16127之间,以抗E蛋白抗体效价最高,达1∶16127,而抗NS3、NS4b、NS5蛋白抗体效价较低,仅为1∶400。利用DENV‐2感染的Vero细胞和稳定表达病毒蛋白的EAhy926细胞进行IFA染色,抗DENV‐2各蛋白的抗血清均可特异性识别DENV‐2抗原。蛋白免疫印迹结果显示,抗E、NS1、NS4b和NS5蛋白抗体能识别热变性蛋白,其他抗血清未呈现阳性反应条带。本研究提示,DNA免疫小鼠所获得的抗DENV‐2各蛋白抗体能特异性识别自然感染或模拟自然感染状态下的DENV‐2蛋白,可为后续相关研究提供工具,也表明DNA免疫法可作为抗体制备的一种策略。     

溴代2(5H)-呋喃酮对绿脓杆菌生物膜形成的抑制作用

研究溴代2(5H)-呋喃酮化合物作为细菌群体感应抑制剂.对绿脓杆菌P.aeruginosa(PA)生物膜(biofilms,BF)形成的影响.首先试验化合物对细菌的最低抑制浓度(MIC)和生长曲线,选择1/2 MIC的化合物浓度进行实验;平板培养法培养绿脓杆菌7 d.得到成熟BF,用扫描电镜和原子力显微镜观察溴代2(5H)-呋喃酮对BF形态结构的影响.初步生物活性试验显示溴代2(5H).呋喃酮对革兰氏阴性菌PA的生物膜形成具有明显抑制作用,扫描电镜和原子力显微镜观察可见BF被破坏,基质样物变稀疏,细菌群聚大为降低.     

HBV感染中抗-(抗-HBs)独特型抗体的研究

1.75％聚乙二醇(MW6000)沉淀血清免疫复合物后,采用ELISA法检测上清中抗独特型抗体〔抗-(抗-HBs)〕。56例急性HBV感染患者血清IgM抗-(抗-HBs),第一周检出率最高(60.00％),1个月后大部分阴性,IgG抗-(抗-HBs)维持时间略长。IgM抗-(抗-HBs)较HBsAg/IgM和IgM抗-HBc消失早,将有利于急性HBV感染的诊断。27例CAH和29例CPH,IgM和IgG抗-(抗-HBs)阳性率约为38～52％,两型间无显著差异(p>0.5)。3例无症状HBsAg携带者和12例HBsAg血清疫苗接受者血清,抗-(抗-HBs)阴性。115例HBV感染者中,IgM抗-(抗-HBs)阳性者HBsAg阳性率(93.62)显著高于IgM抗-(抗-HBs)阴性者(52.31％),p<0.005;反之,HBsAg阳性血清IgM抗-(抗-HBs)阳性率(55.5S％)显著高于HBsAg阴性血清(9.68％),p<0.005;IgM抗-(抗-HBs)阳性和阴性血清的HBVDNA阳性率有显著差异(p<0.025),IgG反应到类似的结果。以上资料表明,抗-(抗-HBs)提示了一些HBV感染患者体内可能存在一种缺陷的反馈机制,导致抗-HBs产生不足而容许更活跃的HBV复制。本文证明了HBV感染患者血清中存在的抗-(抗-HBs)可能是共同决定簇“a”特异性的,还表明抗-HBs人抗-Id反应可能被纯化人血清HBsAg抑制,提示人抗-(抗-HBs)与抗-HBs结合的位点可能在HBsAg与抗-HBs结合位点内或在其附近,这和一些动物抗-(抗-HBs)的研究结果是一致的。     

辣椒温和斑点病毒(PMMV)外壳蛋白基因的克隆和序列测定

从本院分离的辣椒温和斑点病毒株系PMMV-QD中提取RNA.根据已有报道的外壳蛋白(CP)自行设计引物P1、P2,用RT-PCR扩增PMMV-QD的CP基因的cDNA,插入pMD 18-T载体,转化感受态受体菌XL1-B1ue,以蓝白菌落筛选转化株,用PCR检测白色菌落,确认获得了含cDNA的阳性重组子.序列测定和比较的结果表明该片段确含有PMMV的CP基因编码区,此种cDNA与国外报道的PMMV病毒株系核苷酸序列的同源性达到97.7%.     

特异性卵黄抗体(IgY)对小鼠内毒素血症的保护作用

目的:研究特异性卵黄抗体(Egg yolk immunoglobulin,IgY)对小鼠内毒素血症的保护作用.方法:以灭活的E.coli O111免疫产蛋母鸡制备特异性IgY抗体.ELISA法检测对E-coli O111及内毒素(Lipopolysaecharide,LPS)的结合活性.腹腔注射LPS(2mg/m1),0.1 ml/10g体重,建立小鼠内毒素血症模型.小鼠随机分为5组,分别给药保护:空白组(生理盐水)、阴性对照组(非特异性IgY,20mg/ml)、阳性对照组(头孢哌酮钠,20mg/ml)、高剂量组(特异性IgY,40mg/m1),低剂量组(特异性IgY,20mg/ml).给药剂量为:攻毒前,0.15 ml/l0 g体重,24 h一次,共两次;攻毒后,0.25 ml/10 g体重,24 h一次,共7次.观察小鼠一般情况,体重变化,外周血中白细胞(WBC)和血小板(PLT)数的变化及各组小鼠的死亡率.结果:特异性IgY与E.coli O111及LPS均有体外结合活性.LPS感染后,各组小鼠外周血中WBC和PLl均有不同程度的下降,体重下降.特异性抗体保护组各指标较快恢复到正常水平,其他组恢复缓慢.各组小鼠七天内死亡率分别为:空白组,100%;阴性对照组,85%;阳性对照组,30%;低济量组,30%;高剂量组,0%.结论:特异性IgY对内毒素血症小鼠有保护作用.     

重症急性胰腺炎患者血清IL-6水平与内毒素移位及肠黏膜紧密连接蛋白表达关系的研究(英文)

目的:大量研究表明重症急性胰腺炎(SAP)患者血清中高浓度IL-6和肠黏膜低表达的紧密连接蛋白可促进内毒素移位的发生。本文主要研究重症胰腺炎患者血清IL-6水平对内毒素移位和肠黏膜紧密连接蛋白表达的影响。方法:50例重症胰腺炎患者,其中12例在患病早期因结肠受累合并腹胀,对12例结肠受累患者应用结肠镜行结肠灌洗进行腹腔减压,同时取结肠黏膜进行活组织检查。所有病人在治疗的第3天,第7天,第10天,第14天抽取外周静脉血。40例健康志愿者作为对照组。应用ELISA方法检测血清IL-6水平,鲎试验(LAL)方法检测血清内毒素含量,应用免疫荧光和Western blotting方法检测肠黏膜紧密连接蛋白表达水平。结果:SAP患者血清IL-6和内毒素含量明显高于健康对照组,而结肠黏膜紧密连接蛋白表达低于对照组;在临床治疗过程中,早期SAP患者血清IL-6和内毒素水平高于晚期(P值均0.05)。SAP早期血清高浓度的IL-6与结肠黏膜紧密连接蛋白的低表达具有相关性,差异有统计学意义(r=0.735,P0.05)。结论:血清IL-6水平可作为早期评价重症急性胰腺炎严重程度的一项指标,IL-6水平与重症急性胰腺炎临床病程有相关性,可能导致肠道内毒素移位。     

脑膜炎双球菌蛋白菌苗和多糖菌苗中脂多糖(内毒素)的测定

<正>脂多糖(LPS)、荚膜多糖(PS)、外膜蛋白(OMP)和伞毛(菌毛)是革兰氏阴性菌细胞表面抗原。由于LPS有各种毒性反应故称之为内毒素。除LPS外,其它表面抗原可用来制造菌苗。脑膜炎双球菌荚膜多糖菌苗和外膜多糖菌苗已用于预防脑膜炎双球菌感染。当非肠道使用的脑膜炎荚膜多糖(PS)菌苗、沙门氏伤寒ViPs菌苗和脑膜炎蛋白(OMP)菌苗含有LPS时,会引起发烧和其它反应。而对于OMP菌苗要想不使蛋白抗原变性而彻底除去LPS是不可能的。所以,菌苗中的LPS应设法降低其含量达不至于引起发烧或其它异常反应的水平。在这些制品的质量检定中,—个特定剂量的家兔热原试验应为阴性。 Gotschlich等人报道用10ng/kg或更高剂量的脑膜炎菌LPS静脉注射家兔会引起明显的体温上     

绿脓杆菌抗毒素精制方法与效价测定方法的研究

本文采用胃酶消化──硫酸铵盐析法对绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）免疫马血浆进行了试制提纯,对该法酶处理及热变性中影响精制效果的几个主要因素进行了比较试验,同时对文中采用的４种效价测定方法进行了筛选。结果表明,胃酶消化法可用于ＰＥＡ免疫马血浆的精制;效价测定以生物学方法（细胞毒性中和试验、小鼠致死毒性中和试验）为佳。综合比较试验的结果,本文拟订了ＰＥＡ免疫马血浆精制的“修订法”并与“常规法”进行了精制比较。初步结果表明,修订法的精制效果优于常规法。     

铜绿假单胞菌注射液联合顺铂治疗消化道恶性腹腔积液的临床研究

目的：比较铜绿假单胞菌注射液联合顺铂与单纯使用顺铂治疗消化道恶性腹腔积液的疗效。方法：将250例消化道恶性中等量以上腹腔积液患者分为对照组和实验组各125例。所有患者行穿刺置管引流术,地塞米松预防发热,予盐酸利多卡因预防腹痛。铜绿假单胞菌注射液每周两次,顺铂每周一次,疗程一周,最多两个疗程。结果：实验组患者有效率为85．6％,其中,完全缓解40例,部分缓解67例。对照组例患者有效率为52％,其中,完全缓解24例,部分缓解4l例。两组比较差异有统计学意义（x2=32．87,P〈0．05）。实验组患者WHO体力状态评分（1分和2分）为104例,有效率为83．2％;对照组患者WHO体力状态评分（1分和2分）为72例,有效率为57．6％。两组比较差异有统计学意义（x2=19．67,P〈0．05）。结论：铜绿假单胞茵注射液联合顺铂腹腔内给药治疗消化道恶性腹腔积液。临床疗效显著。     

流感病毒M2蛋白胞外区与铜绿假单胞菌外毒素A融合蛋白的表达及其免疫原性研究

本研究构建了表达甲型流感病毒M2蛋白胞外区与铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)融合蛋白的原核表达载体,根据铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)核苷酸序列设计突变PCR引物并实施突变PCR,以获得PEA基因编码区第553位氨基酸密码子缺失的突变PEA(ntPE),从而产生无毒性的PEA突变基因,然后用合成的M2e编码区替换ntPE基因中的非必需区Ib,产生ntPE-M2e嵌合基因。将该嵌合基因导入pET表达载体以构建原核表达载体,将表达产物胶回收后与弗氏不完全佐剂联合皮下免疫BALB/c小鼠,终免两周后用5个LD50流感病毒A/PR/34/8株进行攻击。取动物血清作ELISA并取脾脏作ELISPOT试验结果表明,免疫组可以诱导小鼠产生抗M2e特异性抗体反应和细胞免疫反应并能够抑制病毒在肺内的复制。本研究为甲型流感病毒广谱疫苗的进一步研发打下了基础。     

我院2008-2011年抗菌药物使用量与铜绿假单胞菌耐药相关性的研究

目的:探讨2008-2011年我院抗菌药物使用与铜绿假单胞菌(PA)耐药水平变化之间的关系.方法:计算10种抗菌药物平均每日每百张床住所消耗的限定日剂量(DDD)及同期PA的耐药率,并对抗菌药物用量与耐药率进行相关性分析.结果:发现头孢哌酮/舒巴坦及左氧氟沙星DDD分别与铜绿假单胞菌对头孢噻肟、头孢吡肟、左氧氟沙星、亚胺培南、头孢噻肟、头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟耐药率的相关性有统计学意义,其它组数据无统计学意义.结论:呼吸病区左氧氟沙星及头孢哌酮/舒巴坦DDD的使用量与PA耐药率相关.     

Analysis of peptide uptake in Pseudomonas aeruginosa: A fluorescamine labeling procedure

Intracellular products of peptide transport were analyzed after thin layer chromatography separation by a fluorescamine labeling procedure. Dipeptides penetrated Pseudomonas aeruginosa via 2 transport systems, one of high affinity with K_T values from 1–2 μM, and another one of low affinity (K_T about 30 μM). A single transport system assumed tripeptide uptake with K_T varying from 10–30 μM, depending on the tripeptide used. Peptides entering the cells were rapidly hydrolyzed into their constitutive amino acids.     

铜绿假单胞菌OprF/I融合蛋白疫苗研制现状

铜绿假单胞菌是一种革兰阴性非发酵和需氧的机会性致病菌,是医院获得性感染的常见病原体。铜绿假单胞菌治疗面临巨大挑战,研制疫苗是防治铜绿假单胞菌感染的有效替代方法。融合外膜蛋白OprF/I是一种保护性抗疫苗以及重组沙门菌疫苗的研制现状进行综述。     

Analysis of antibiotic resistance gene expression in Pseudomonas aeruginosa by quantitative real-time-PCR

In Pseudomonas aeruginosa many of the clinically relevant resistance mechanisms result from changes in gene expression as exemplified by the Mex drug efflux pumps, the AmpC beta-lactamase and the carbapenem-specific porin OprD. We used quantitative real-time-PCR to analyze the expression of these genes in susceptible and antibiotic-resistant laboratory and clinical strains. In nalB mutants, which overexpress OprM, we observed a four- to eightfold increase in the expression of mexA, mexB, and oprM genes. MexX and mexY genes were induced eight to 12 times in the presence of 2 mg L(-1) tetracycline. The mexC/oprJ and mexE/oprN gene expression levels were increased 30- to 250-fold and 100- to 760-fold in nfxB and nfxC mutants, respectively. We further found that in defined laboratory strains expression levels of ampC and oprD genes paralleled beta-lactamase activity and OprD protein levels, respectively. Our data support the use of quantitative real-time-PCR chain reaction for the analysis of the antimicrobial resistance gene expression in P. aeruginosa.     

连续七年铜绿假单胞菌的临床分布及耐药性变化分析

了解铜绿假单胞菌在医院的动态分布及耐药情况变化,防止耐药菌株的传播及暴发流行。细菌鉴定采用法国生物梅里埃公司的API 20NE和VITEK2系统,药敏试验采用K-B纸片扩散法,结果判定按照2005版CLSI的标准,药敏结果分析采用WHONET5.3。7 a共分离铜绿假单胞菌2 220株,主要来源于病房的呼吸道标本,分离的细菌数逐年增加,连续7 a监测了14种抗菌药物,均有不同程度的耐药,且耐药率有逐年增加的趋势,尤其是从2003年起ICU病房成立后,ICU病房分离的PA数占总数的30%以上,引起总体耐药率的明显增加。动态监测铜绿假单胞菌的耐药情况,对临床治疗其引起的感染具有十分重要的意义。     

谷胱甘肽与铜绿假单胞菌致病性的关系

铜绿假单胞菌由于对抗生素的固有耐药和多重抗药性, 已成为医院内感染的重要病原菌之一。谷胱甘肽是细胞内最重要的抗氧化剂, 保护细胞免受氧化压力的损害。但是在铜绿假单胞菌感染的组织中, 由于绿脓菌素等致病因子的存在, 可以导致谷胱甘肽的水平降低。同时, 谷胱甘肽又可以增强绿脓菌素的致病性。本文就谷胱甘肽与铜绿假单胞菌关系的最新研究进展并结合作者的工作, 对上述问题进行了综述和探讨。     

绿脓杆菌PA—103株产毒条件及外毒素A提取纯化的研究

绿脓杆菌PA—103株产毒培养基是用本室研制的胰蛋白酶消化大豆粉透析外液制成的.培养基除铁后Fe~+含量为0.13μm/ml,蛋白水解物6.9mg/ml,氨基酸含量76mg/100ml,均接近进口培养基水平.经振荡培养,提取纯化了外毒素A.粗制外毒素A经DE_(52)阶段洗脱,DE_(52)梯度洗脱,LKBACA_(44)超凝胶过虑以及羟基磷灰石柱等四步纯化.精制外毒素A小鼠毒性致死试验提高到1:64,接近文献值.LD50>300LD50/ml,园盘电泳分析为单一成份,由天门冬氨酸等17种氨基酸组成.