蛋白-O-岩藻糖基转移酶1在结直肠癌中的表达及临床意义

目的观察蛋白-O-岩藻糖基转移酶1(protein O-fucosyltransferase 1,POFUT1)在结直肠癌中的表达情况,研究其在结直肠癌早期诊断中的意义。方法通过Oncomine与UALCAN数据库获取TCGA及非TCGA库中POFUT1的基因表达量数据,分析POFUT1在癌症中的表达情况;通过免疫组织化学技术(IHC)检测结直肠癌组织及其对应的癌旁组织与远癌组织中POFUT1的表达情况。结果数据库资料分析结果表明,POFUT1在多种癌症组织尤其是结直肠癌组织中高表达;IHC结果显示,结直肠癌组织中POFUT1的阳性表达率明显高于其对应的癌旁组织与远癌组织。结论 POFUT1可能成为结直肠癌早期诊断的新型分子标志物之一。     

小鼠α1，2岩藻糖基转移酶基因的克隆及表达

本文报告小鼠GDP岩藻糖：β半乳糖苷α1,2-岩藻糖基转移酶（α1,2-fucosyltansferase,α1,2-FT）基因的克隆,并进行功能鉴定。利用RT—PCR方法克隆小鼠α1,2-岩藻糖基转移酶基因编码区MFUT-II,测序后将其插入表达载体pcDNA3．1的多克隆位点,构建表达载体pcDNA3．1-MFUT-II;采用磷酸钙法将其转染于COS-7细胞进行表达,通过对底物特异性比较研究酶的性质;应用Northern印迹杂交法研究基因在小鼠组织中的表达情况;应用Southern印迹杂交法分析基因存在状态。结果证实MFUT-II为小鼠α1,2-岩藻糖基转移酶基因家族的新成员。含有一个完整的开放读码框。可编码347个氨基酸。其估计分子质量为39kDa,和小鼠日及Sec1基因具有序列同源性。分别与人类Se基因（79．O％）、大鼠Ratrrs（89％）基因、兔Rabbit FT-III基因（77％）具有较高的序列同源性。用MFUT-II基因转染的COS-7细胞具有α1,2-FT活性。MFUT-II可在多种组织中产生3．5kb大小的mRNA转录产物。基因Southern印迹杂交分析结果显示：基因MFUT-II仅为一个拷贝。这些结果证明MFUT-II为小鼠的Se基因。     

马尾松PmPGK1和PmGPIC基因的克隆和表达分析

为了解马尾松（Pinus massoniana）磷酸甘油酸激酶1（PGK1）与胞质溶胶葡萄糖磷酸异构酶（GPIC）的功能，采用RACE技术克隆了PmPGK1和PmGPIC基因，并进行了生物信息学分析与亚细胞定位，采用实时荧光定量PCR技术分析PmPGK1和PmGPIC的表达特性。结果表明，PmPGK1和PmGPIC全长为2 106和1 848 bp，分别编码507和566个氨基酸。PmPGK1和PmGPIC分别定位于叶绿体和胞质溶胶。PmPGK1表达量为新叶 > 老叶 > 新茎 > 根 > 花；而PmGPIC为老叶 > 花 > 新叶 > 新茎 > 根。低温胁迫24 h，PmPGK1和PmGPIC的表达量均随时间延长先降低后升高，且PmGPIC的表达量在处理2 h后即降至较低水平；高浓度CO₂胁迫24 h，PmPGK1的表达量随时间延长呈降低-升高-再降低的变化趋势，PmGPIC的表达下调但变化较不显著。因此，推测PmPGK1主要参与卡尔文循环及叶绿体/质体糖酵解，PmGPIC主要参与细胞质基质糖酵解；PmPGK1、PmGPIC活性在低温胁迫下均受抑制；PmPGK1活性在CO₂胁迫下受到显著抑制，而PmGPIC活性的影响不大。     

基因CfATG6和CfATG14参与调控果生刺盘孢细胞自噬和致病力

【目的】炭疽病是油茶的主要病害,由刺盘孢属的多种真菌引起,其中果生刺盘孢分布范围最广、分离率最高,是油茶炭疽病的主要致病菌。研究自噬相关蛋白CfAtg6和CfAtg14的生物学功能,为进一步揭示果生刺盘孢通过细胞自噬调控致病的分子机制,并为油茶炭疽病的防治提供理论基础。【方法】根据同源重组原理,通过聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)介导的方法,在果生刺盘孢中敲除基因CfATG6和CfATG14,并进一步获得回补菌株ΔCfatg6-C和ΔCfatg14-C。【结果】酵母双杂交试验结果显示,果生刺盘孢蛋白CfAtg6和CfAtg14可能存在互作关系。生物学表型测定结果表明,相较于野生型和回补菌株,突变体ΔCfatg6和ΔCfatg14均表现出营养生长速率显著减慢,附着胞形成率分别只有野生型的5%和18%;突变体ΔCfatg6和ΔCfatg14致病力均极显著减弱,造成的油茶叶片病斑面积少于野生型和回补菌株的1/3;CfATG6和CfATG14基因缺失突变体均丧失转运和降解CfAtg8蛋白的能力,并对细胞壁胁迫更敏感。突变体ΔCfatg6的分生孢子产量显著降低,仅为野生型的20%左右;氧化胁迫试验结果表明,相较于野生型和回补菌株,过氧化氢对突变体的生长抑制率升高10%左右。内质网压力胁迫试验表明,ΔCfatg14对二硫苏糖醇抑制率升高5%以上。【结论】自噬相关基因CfATG6和CfATG14参与调控了果生刺盘孢生长发育、细胞自噬和致病力。     

番茄LeRma1基因的克隆与表达

以番茄‘哈大粉801’为试材,利用RT-PCR技术,克隆得到1个E3泛素蛋白连接酶基因LeRma1（GenBank登录号XM_004243764.1）。对LeRma1基因进行序列分析,并对LeRma1基因在番茄植株的不同部位以及在非生物胁迫（干旱、盐、碱、高温、低温）下的表达和生理特性进行研究,为培育和改良番茄品种提供理论依据。结果表明：（1）序列分析显示,LeRma1基因的cDNA全长序列729 bp,编码242个氨基酸,分子量为27.05 kD,理论pI 7.97;同源分析显示,番茄LeRma1蛋白与马铃薯的一致性最高（91%）。（2）半定量PCR检测表明, LeRma1基因在番茄根、茎、叶、花、果实中均有表达,且表达差异不明显。（3）干旱胁迫下,LeRma1基因在番茄叶片中优势表达,而在整个干旱过程中根部的LeRma1基因表达量变化不明显;抗旱相关基因LEA、 DREB2A、ABI3在干旱胁迫过程中,番茄叶片中均有表达,且其表达量呈上升趋势,而在根部DREB2A、ABI3基因基本没有检测到。（4）干旱胁迫过程中,番茄植株中丙二醛（MDA）含量呈显著升高趋势,质膜系统严重损伤,体内保护酶（SOD、POD、CAT）活性上升,且根部活性总体明显高于叶片。（5）在非生物逆境（盐、碱、高温、低温）胁迫过程中,LeRma1基因在番茄叶片和根部的表达几乎都有增强的趋势,且在叶片中均是胁迫3 h后诱导起始增强表达。研究认为,LeRma1基因是一个受干旱胁迫诱导增强表达的基因,且在叶片中优势表达,说明LeRma1基因对植物耐受干旱胁迫所起的作用存在一定的组织差异性,而且LeRma1基因可能参与番茄的干旱应答及信号转导过程,在番茄抵抗其他非生物胁迫中LeRma1基因也可能具有一定的作用。     

金黄色葡萄球菌tst-1基因敲除菌株的构建

抽提金黄色葡萄球菌834菌株的基因组DNA,PCR克隆扩增tst-1及tst-1的上、下游基因,通过将tst-1上、下游基因分别重组到载体质粒pAULA中,形成同源重组质粒pAULA Δtst-1,将pAULA-Δtst-1电转入细菌内,进行同源重组,以PCR、Western blot鉴定tst-1基因敲除菌株无tst-1基因片段,且无TSST-1蛋白表达,表明已成功构建金黄色葡萄球菌tst-1基因的敲除菌株。     

α1,2-岩藻糖基转移酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用PCR方法从幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,HP)基因组DNA中获得α1,2-岩藻糖基转移酶(α1,2-fuco-syltransferase,α1,2-fuct)基因,得到大小为906 bp的目的基因,将其定向插入到原核表达载体pET-22b(+)中,得到重组表达载体pET-fuct。将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,25℃,0.1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达4 h,并用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况。结果表明,可表达出相对分子质量为33 kD的蛋白,与预期分子量一致,说明α1,2-岩藻糖基转移酶在大肠杆菌BL21中实现表达,应用HPLC法进行酶活检验,酶活达到了13.21 pmol/(mgPr.h)。     

乌拉尔图小麦Viviparous-1基因的单倍型及其表达特性研究

该研究采用PCR和半定量RT-PCR方法,对乌拉尔图小麦（Triticum urartu）休眠基因Viviparous-1A（Vp-1A）的单倍型进行分析,并通过建立系统进化树,对Vp-1A基因在乌拉尔图小麦、普通小麦和其他近缘种间的系统发育关系进行分析。结果表明：（1）在20份乌拉尔图小麦中共发现4种新等位变异类型,分别命名为TuVp-1Abgi、TuVp-1Adfi、TuVp-1Aefi和TuVp-1Acgh。与普通小麦的TaVp-1Aa(AJ400712)基因相比,这4种单倍型主要是在第3内含子中有多个TTC不同重复,在第2和第5内含子中存在序列的缺失以及SNPs;（2）用ABA处理种子胚后,4种不同单倍型材料的mRNA表达水平发生变化,表明这4种单倍型对ABA敏感性不同;（3）乌拉尔图小麦中Vp-1A基因不同单倍型,在第2、第3和第5内含子中碱基序列的插入和缺失,影响了Vp-1A基因的表达特性及对ABA的敏感性,从而影响种子休眠特性;（4）鉴定和分析发现,乌拉尔图小麦TuVp-1Adfi单倍型可作为小麦穗发芽抗性资源。     

综述: 糖基转移酶超家族在肿瘤转移中的作用

蛋白质的糖基化修饰主要包括N-连接糖基化、O-连接糖基化和糖基磷脂酰肌醇锚定连接．与核酸和蛋白质不同,糖链的合成过程并不遵循传统的基因信息传递的中心法则,主要由一系列催化糖苷键形成的糖基转移酶完成．异常糖基化修饰被认为与恶性肿瘤的发生发展和临床预后密切相关．研究表明,糖基转移酶的表达及其糖链结构的异常可通过调节肿瘤细胞与细胞外基质的相互作用,继而影响肿瘤转移的关键步骤,如上皮间质转化(E-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白)、细胞的移动性(整合素β1和α5)、侵袭(基质金属蛋白酶MMPs)、浸润(唾液酸化Lewis抗原sLeX和sLeA)．本文主要就唾液酰基转移酶、岩藻糖基转移酶和N-乙酰氨基葡萄糖转移酶等三大糖基转移酶家族的结构和生物学功能及其在肿瘤转移中的作用作一综述,以期为肿瘤转移的预测和诊断提供新思路．     

鸡zp1基因对成骨细胞矿化的影响

本研究旨在克隆编码鸡透明带1（zona pellucida 1,Zp1）蛋白的zp1基因,并研究其组织表达谱及在成骨细胞矿化中的作用。利用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测蛋鸡不同组织和性成熟启动前后胫骨中的zp1表达水平;将Zp1过表达载体转染至诱导分化8 d的鸡颅骨成骨细胞内,检测细胞外矿化基质和矿化相关基因表达。结果表明,鸡zp1基因全长3 045 bp,编码958个氨基酸残基,具有2个N-糖基化位点。zp1基因在产蛋期鸡肝脏中高水平表达,其次为胫骨和卵黄膜,在蛋壳腺和心脏中不表达。鸡性成熟启动后血浆雌激素（estrogen,E2）、胫骨糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）含量和zp1表达量均极显著高于性成熟启动前。在过表达Zp1的鸡成骨细胞中添加雌激素后,细胞外矿化基质和矿化相关基因表达水平均显著升高。因此,zp1基因表达具有组织特异性,在雌激素作用下正向调控鸡成骨细胞矿化,为阐明Zp1在鸡产蛋期骨骼中的功能特性奠定了理论基础。     

丝裂原活化蛋白激酶基因CfMKK1调控果生炭疽菌的生长发育和致病力

【目的】由果生炭疽菌引起的炭疽病是油茶的主要病害,造成油茶产量下降。本文研究果生炭疽菌中丝裂原活化蛋白激酶CfMkk1的生物学功能,旨在为解析油茶炭疽病菌的致病机理提供依据。【方法】根据同源重组原理构建CfMKK1基因敲除载体片段,采用PEG介导法将载体导入原生质体中筛选获得突变体菌株DCfmkk1;PCR扩增果生炭疽菌含有启动子的CfMKK1基因回补片段,构建回补载体pYF11::CfMKK1;采用PEG介导法把回补载体转化至突变体的原生质体中,荧光筛选回补菌株ΔCfmkk1-C。测定野生型菌株、突变体菌株DCfmkk1及基因回补菌株ΔCfmkk1-C在营养生长、附着胞形成、胁迫应答和致病力等生物学表型。【结果】与野生型和回补菌株相比,CfMKK1基因敲除突变体ΔCfmkk1菌丝生长速率明显减缓;在含刚果红的PDA培养基上菌丝生长受到明显抑制,无法穿透玻璃纸,丧失了侵染寄主的能力;而且无法形成附着胞。【结论】研究结果表明CfMKK1基因参与调控油茶果生炭疽菌的生长发育、附着胞形成、致病力以及响应外界胁迫过程。     

油茶果生炭疽菌小分子GTP酶Rab7的功能研究

【目的】炭疽病是油茶的一种重要病害,果生炭疽菌是油茶炭疽病的主要致病菌。本文对果生炭疽菌小分子GTP酶Rab7进行研究,为油茶炭疽病的防控治理提供依据。【方法】构建CfRAB7基因敲除载体,通过PEG介导的原生质体转化、抗性筛选和PCR电泳验证获得果生炭疽菌突变体菌株△Cfrab7和互补菌株△Cfrab7/CfRAB7。进一步分析CfRAB7基因敲除突变体△Cfrab7的生长、产孢、附着孢的形成、胁迫应答、液泡融合和致病力等生物学表型。【结果】在PDA和MM培养基上,突变体△Cfrab7的菌落直径显著减小,产孢量和附着孢形成率显著降低,且不能穿透玻璃纸;在10mmol/LH2O2条件下,△Cfrab7生长受到明显抑制;进一步研究发现突变体△Cfrab7液泡无法正常融合,在油茶有伤和无伤的幼叶上均不发病。【结论】CfRAB7基因参与调控果生炭疽菌生长产孢、附着孢形成、H2O2胁迫应答、液泡融合和致病力。     

暹罗炭疽菌同源异型盒转录因子CsHtf1的生物学功能

【背景】暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)是橡胶炭疽病害的主要致病菌,严重制约着天然橡胶产量。在植物致病真菌中广泛存在同源异型盒转录因子,其参与调控真菌无性生殖、侵染和代谢等诸多方面。【目的】明确在暹罗炭疽菌中鉴定的一个同源异型盒转录因子CsHtf1的生物学功能。【方法】利用同源重组的方法获得Cshtf1基因的敲除突变株,并对其营养生长、孢子产生和致病性等表型进行分析。【结果】Cshtf1基因编码600个氨基酸且含有1个HOX结构域;与野生型相比,Cshtf1敲除突变株营养生长和致病性无显著差异,而突变株分生孢子产量显著降低且黑色素产量增加。【结论】CsHtf1参与调控暹罗炭疽菌的分生孢子及黑色素产生。     

橡胶树暹罗炭疽菌Zn2Cys6型转录因子CsGcc1的生物学功能

【背景】暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense）是一种重要的病原真菌,可以引起炭疽病,给全球橡胶产业带来巨大的经济损失。Zn₂Cys₆型转录因子是真菌特有的锌指类转录因子,通常参与调控真菌的生长发育过程。【目的】在暹罗炭疽菌中鉴定了一个与稻瘟病菌Gcc1同源的Zn₂Cys₆型转录因子CsGcc1,并研究其功能。【方法】根据同源重组原理构建CsGCC1的基因敲除突变体,并通过营养生长、H₂O₂敏感性、分生孢子产生及萌发、玻璃纸试验和致病性分析,明确CsGcc1的功能。【结果】CsGcc1编码一个含有646个氨基酸的蛋白,而且含有一个GAL4结构域。CsGCC1基因在培养36 h的菌丝及分生孢子中具有较高的表达量。CsGCC1基因敲除突变株营养生长速率降低且对H₂O₂更加敏感。相较于野生型菌株,突变株的分生孢子产量、萌发率及附着胞形成率均降低。此外,CsGCC1的敲除可以明显降低分生孢子的穿透能力,突变株对橡胶叶片的致病力减弱。【结论】Zn₂Cys₆型转录因子CsGcc1参与调控暹罗炭疽菌的营养生长、氧化应激、分生孢子发育及致病性等过程。     

胶孢炭疽菌C2H2型转录因子CgGcp1的生物学功能

【背景】胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)可以寄生于多种植物,侵染方式多样,能够引起严重的农业危害。在胶孢炭疽菌中,CgGcp1是一个C2H2型的转录因子,关于其生物学功能的研究未见报道。【目的】明确CgGcp1的生物学功能,为深入解析该病菌的致病机制奠定一定的理论依据。【方法】构建CgGCP1基因的敲除载体,利用同源重组得到敲除突变体。通过表型分析,包括营养生长、胁迫响应、孢子产生、附着胞形成及致病性分析等,明确该基因的生物学功能。【结果】CgGCP1基因敲除突变体生长速率较野生型减慢,对SDS、刚果红、NaCl和甘油更加敏感,孢子产量显著降低,附着胞的形成率降低且侵入能力减弱,在橡胶叶片上的致病力明显下降。【结论】CgGcp1参与调控胶孢炭疽菌营养生长、细胞壁完整性、分生孢子产生、附着胞形成与侵入和致病性。     

Genome Analysis inNeurospora crassa;Cloning of Four Lociarginine-1(arg-1),methionine-6(met-6),unknown-7(un-7), andribosome production-1(rip-1) and Associated Chromosome Walking

We have cloned fourNeurospora crassagenes by complementation analysis. Cloned genes include thearginine-1(arg-1),methionine-6(met-6),unknown-7(un-7), andribosome production-1(rip-1) loci. Chromosome walks were initiated in ordered cosmid libraries from the cloned loci. A total of about 700 kb of theNeurosporagenome is covered in these walks.     

桃树根部内生真菌ZJ-4的分离鉴定及其对桃褐腐病的抑制效果

自桃树根部组织中分离能够防治桃褐腐病害的内生拮抗真菌,并从细胞学水平对其抑制机理进行了初步的探究。采用两点对峙法筛选抑制桃褐腐病菌Monilinia fructicola的内生拮抗真菌,通过菌落形态学特点观察及ITS基因测序分析,初步鉴定内生拮抗真菌的系统发育学地位;采用果实离体实验检测内生拮抗真菌的抗菌效果;使用电子显微镜观察被内生拮抗真菌抑制的桃褐腐病菌丝、孢子的形态以及细胞结构的变化。分离得到的内生真菌ZJ-4对桃褐腐病防效高且稳定,初步鉴定为篮状菌属Talaromyces;果实离体试验表明,内生真菌ZJ-4明显降低了桃褐腐病的发病率;通过电子显微镜观察到被内生真菌ZJ-4抑制的桃褐腐病菌丝及孢子表面粗糙凹陷,畸形现象严重,胞质溶胶收缩凝聚,细胞内部出现大量的空腔。本研究筛选的ZJ-4对桃褐腐病原菌的生长有明显的抑制作用,为开发应用该菌株提供参考。     

AtBS14a and AtBS14b, two Bet1/Sft1-like SNAREs from Arabidopsis thaliana that complement mutations in the yeast SFT1 gene

SNAREs are membrane-associated proteins that play a central role in vesicle targeting and intra-cellular membrane fusion reactions in eukaryotic cells. Here we describe the identification of AtBS14a and AtBS14b, putative SNAREs from Arabidopsis thaliana that share 60% amino acid sequence identity. Both AtBS14a and BS14b are dosage suppressors of the temperature-sensitive growth defect in sft1-1 cells and over-expression of either AtBS14a or AtBS14b can support the growth of sft1Δ cells but not bet1Δ cells. These data together with structure–function and biochemical studies presented herein suggest that AtBS14a and AtBS14b share properties that are consistent with them being members of the Bet1/Sft1 SNARE protein family.