铜绿假单胞菌PAO1 ku基因缺失菌株的构建及其对生物被膜耐药性的影响

【背景】铜绿假单胞菌是常见的条件致病菌,易形成生物被膜,具有基因突变率高、耐药性强的特点。非同源末端连接是DNA双链断裂的主要修复途径之一,修复过程会导致DNA突变产生。【目的】研究非同源末端连接对生物被膜中的铜绿假单胞菌基因突变率和耐药性的影响。【方法】通过基因无痕敲除的方法构建PAO1菌株的ku基因缺失突变株Δku并构建其回补株。对比研究突变株和野生菌株生物被膜形成能力、生物被膜状态下各菌的基因突变率以及对抗生素的耐受性。通过荧光定量PCR检测生物被膜中PAO1菌株ku基因的表达水平。【结果】各突变株生物被膜形成能力无显著差异;与野生菌株相比,突变株Δku在生物被膜中的基因突变率以及对环丙沙星和庆大霉素的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)下降。荧光定量PCR结果表明,ku基因在生物被膜形成早期转录水平有明显上调。【结论】非同源末端连接修复途径对生物被膜中的铜绿假单胞菌基因突变率以及耐药性的提高有一定的作用。本研究将为后续进一步阐释铜绿假单胞菌耐药产生机制提供一定的理论依据。     

c-di-GMP的磷酸二酯酶PA4781在抗菌肽Merecidin抑制铜绿假单胞菌生物被膜中的作用

【背景】抗菌肽Merecidin可抑制临床菌株铜绿假单胞菌PA03生物被膜。PA4781基因是课题组通过生物信息学分析筛选出的差异表达基因,PA4781作为细菌第二信使分子环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)的磷酸二酯酶具有降解c-di-GMP的作用,其在抗菌肽Merecidin抑制生物被膜中的作用机制尚不清楚。【目的】研究细菌第二信使分子c-di-GMP的磷酸二酯酶PA4781基因在抗菌肽Merecidin抑制铜绿假单胞菌生物被膜中的作用。【方法】利用单碱基突变技术敲除PA4781基因,Sanger测序方法检测敲除的正确性。采用结晶紫染色法观察PA03菌株、PA4781过表达菌株、PA4781敲除菌株24 h生物被膜生长情况,以及在抗菌肽Merecidin 24、48、72μmol/L作用下各菌株生物被膜的生长情况。采用对羟基联苯溶液显色法检测在抗菌肽Merecidin 48、72μmol/L作用下,PA03菌株、PA4781过表达菌株、PA4781敲除菌株生物被膜藻酸盐的变化情况。【结果】Sanger测序结果显示,用pnCasPABEC系统成功实现了靶点位置的单碱基突变,提前终止了PA4781的转录;结晶紫染色结果显示,培养24h时,在24μmol/L抗菌肽Merecidin作用下PA03菌株、PA4781过表达菌株、PA4781敲除菌株生物被膜形成情况无显著性差异(P0.05),在抗菌肽Merecidin 48、72μmol/L处理下,过表达株与正常株和敲除株有显著性差异(P0.05),生物被膜明显减少,敲除株生物被膜厚度高于PA03组(P0.05)。随着抗菌肽Merecidin浓度升高各组藻酸盐含量下降,其中过表达菌株在抗菌肽Merecidin作用下藻酸盐生成量抑制率最高,可达65%。【结论】抗菌肽Merecidin能够促进细菌第二信使分子磷酸二酯酶PA4781的表达,为抗菌肽Merecidin抑制铜绿假单胞菌生物被膜的作用机制可能通过细菌第二信使分子这一信号途径提供新的研究思路。     

铜绿假单胞菌PAO1中c-di-GMP代谢相关基因PA0575对表型的影响

【背景】铜绿假单胞菌PAO1中存在与环鸟苷二磷酸(cyclic-di-guanosine monophosphate,c-di-GMP)代谢相关基因PA0575。【目的】探讨铜绿假单胞菌PAO1中环鸟苷二磷酸代谢相关基因PA0575对运动能力及生物膜的影响。【方法】通过PCR对菌株遗传背景进行确认;利用刚果红结合实验及电转PcdrA-gfp质粒间接测量胞内c-di-GMP水平;利用泳动性(swimming)、蜂群泳动(swarming)、蹭行运动(twiching)和生物膜定量实验对细菌进行表型分析,并在运动培养基中添加抗生素研究其对运动能力的影响;针对PA0575基因进行融合蛋白表达载体的构建,并对蛋白进行原核诱导表达。【结果】3株突变体菌株的转座子插入突变位点不一致,胞内c-di-GMP水平检测结果显示,PA0575-1菌株的c-di-GMP含量高于野生型PAO1菌株(P0.05),PA0575-2、PA0575-3菌株胞内c-di-GMP水平与野生型PAO1菌株无差异(P0.05)。运动能力检测实验中,与野生型PAO1菌株相比,PA0575-1菌株泳动性增强(P0.05);PA0575-2、PA0575-3菌株的泳动性、蜂群运动均增强(P0.05);该基因不同位点的突变均导致氯霉素对菌株的运动能力产生抑制作用。生物膜定量结果显示,与野生型PAO1菌株相比,细菌培养18 h后PA0575-1的生物膜含量降低(P0.05),PA0575-2、PA0575-3菌株的生物膜含量升高。最后成功构建了PA0575基因不同结构域的8个表达载体,并获得了异源表达蛋白。【结论】PA0575基因降低铜绿假单胞菌胞内c-di-GMP的水平,影响表型的同时也抑制了氯霉素抗性基因的表达。以上研究为PA0575基因对表型的影响奠定了基础。     

铜绿假单胞菌fur基因缺失突变株的构建及其表型分析

铁摄取调节蛋白(ferric uptake regulator, Fur)是控制铜绿假单胞菌铁代谢和毒力的关键调节因子。许多课题组尝试构建铜绿假单胞菌fur的缺失突变株均失败,因此铜绿假单胞菌的fur一直被认为是必需基因,这导致其生物学功能一直未得到全面的解析。【目的】构建铜绿假单胞菌fur的缺失突变株,并对该突变株的表型进行分析。【方法】以铜绿假单胞菌PAO1为亲本菌株,通过同源重组的方法构建fur缺失突变株,研究该基因对铜绿假单胞菌生长、铁载体生物合成、抗氧胁迫能力、鞭毛形成、生物被膜形成和毒力等的影响。同时,通过遗传分析对fur缺失突变株生长缺陷表型的原因进行探究。【结果】本研究成功构建了铜绿假单胞菌fur基因的缺失突变株,发现缺失突变fur极大地限制了铜绿假单胞菌的生长能力,并降低了该菌对限铁环境的生长适应性,但不影响该菌对高铁环境的生长适应性。铜绿假单胞菌Δfur的这种生长缺陷表型是细胞生长增殖变慢造成的,而不是诱导细胞死亡引起的。然而,其他异源的fur基因能完全互补Δfur的这种生长缺陷表型,暗示铜绿假单胞菌的Fur蛋白在功能上不存在独特性。尽管Fur与毒素-抗毒素系统PacTA存在功能关联性,但是铜绿假单胞菌Δfur的这种生长缺陷表型却与PacT毒素无关。除了影响铜绿假单胞菌的生长表型,缺失突变fur还使铜绿假单胞菌丧失了对铁载体生物合成的抑制作用,导致该菌对H₂O₂更敏感并丧失了鞭毛的形成能力,同时降低了该菌对大蜡螟幼虫的毒力。此外,缺失突变fur还显著提升了铜绿假单胞菌的胞内环二鸟苷酸(cyclic diguanylate, c-di-GMP)水平,从而诱导pelF和pslA基因的表达,进而促进铜绿假单胞菌生物被膜的形成。【结论】fur是可以缺失的非必需基因,在铜绿假单胞菌的正常生长、铁载体生物合成、抗氧胁迫能力、鞭毛形成、生物被膜形成和毒力等方面都发挥着十分重要的作用,这为针对铜绿假单胞菌的疫苗和抗菌药物开发奠定了基础。     

细菌群体感应参与铜绿假单胞菌胞内聚羟基脂肪酸酯合成的调控

群体感应是细菌根据细胞密度变化调控基因表达的一种调节机制。铜绿假单胞菌中QS系统由lasI和rhlI合成的信号分子3OC12-HSL和C4-HSL以及各自的受体蛋白LasR、RhlR组成,它们以级联方式调控多个基因表达。【目的】研究细菌群体感应(QS)对聚羟基脂肪酸酯合成的调控。【方法】利用铜绿假单胞菌PAO1及其QS突变株为材料通过气相色谱、荧光定量PCR在生理和分子水平上研究QS对聚羟基脂肪酸酯合成的调控。【结果】QS信号分子合成抑制剂阿奇霉素处理铜绿假单胞菌PAO1和QS突变株导致胞内PHA积累量显著减少;铜绿假单胞菌PAO1中C4-HSL合成酶基因rhlI缺失突变株PAO210胞内PHA积累量与野生型无差别;而3OC12-HSL合成酶基因lasI缺失突变株PAO55、3OC12-HSL受体合成酶基因lasR缺失突变株PAO56以及lasI/lasR双缺失突变株PAO57胞内PHA含量与野生型相比明显减少;lasI和lasR的突变株体内PHA合成酶基因phaC1的表达量显著降低,信号分子3OC12-HSL回补实验使phaC1的表达量可恢复到野生株水平,但只可部分恢复lasI缺失导致的胞内PHA合成。【结论】由此推测,铜绿假单胞菌群体感应系统中lasI/lasR系统参与胞内聚羟基脂肪酸酯合成的调控。     

铜绿假单胞菌水解弹性蛋白能力相关基因的筛选与鉴定

【目的】研究铜绿假单胞菌弹性蛋白水解能力相关基因。【方法】应用人工Mu转座技术构建铜绿假单胞菌野生型菌株PA68的转座突变文库,从2000多个突变子中筛选得到4株弹性蛋白水解能力改变的突变子,并通过克隆及测序获得转座子插入位点侧翼的序列。将铜绿假单胞菌弹性蛋白酶结构基因lasB的转录启始区序列整合入载体pDN19lacΩ并将该重组质粒电转化入野生型菌株PA68及4个突变株中,对报告基因在不同菌株中的表达水平进行测定。【结果】发现4个突变株中Mu转座子分别插入lasA、galU、xcpZ和ptsP 4个基因。ptsP基因失活的突变株中,lasB基因的转录水平是野生型菌株的7%,xcpZ和lasA基因的失活使lasB基因的转录水平分别降低为野生株的54%和75%,galU基因的插入失活使lasB基因的转录上升了1倍。【结论】推测ptsP和galU基因很可能直接或间接地调控着弹性蛋白酶的生物合成。     

铜绿假单胞菌新基因PA0058插入失活对氨基糖苷类抗生素耐药性的影响

【目的】铜绿假单胞菌是一种重要的条件致病菌,临床上常引起难治性和顽固性感染,随着各种抗生素的广泛使用,该菌对多种抗生素呈现耐药性,研究其耐药性机理有着重要意义。【方法】以一株临床分离株Pseudomonas aeruginosa PA68作为出发菌株,应用人工Mu转座技术构建突变文库并从中筛选得到一株对链霉素抗性明显增强的菌株M122,并对突变株M122进行测序分析及表型检测。通过Southern杂交实验证实转座子是否为单拷贝插入,对突变株M122的基因表达谱与野生型PA68菌株进行对比分析。【结果】确定了Mu转座子在M122基因组上为单拷贝插入,插入位点为基因PA0058的第214 bp处。对M122进行表型检测,发现其对多种氨基糖苷类抗生素的耐药性均得到增强,通过转入携带完整基因PA0058的表达质粒可以使突变株M122的耐药性有所降低,利用同源重组的方法,在模式菌株P.aeruginosa PAK中进行PA0058基因敲除,得到的敲除株具有链霉素耐药性升高的表型。基因PA0058的缺失引起多种基因表达水平改变,尤其是katB、ahpC、ahpF等抗氧化酶基因转录表达显著增高。【结论】首次发现铜绿假单胞菌PA0058基因的插入失活提高了细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性,且导致突变株M122中抗氧化酶基因转录表达水平的上调。     

铜绿假单胞菌PAO1中c-di-GMP代谢相关基因PA2072的生物学分析

【背景】铜绿假单胞菌为革兰氏阴性杆菌,是医院感染的常见条件致病菌之一。广泛存在于细菌中的第二信使分子环鸟苷二磷酸(cyclic-di-guanosine monophosphate,c-di-GMP)对细菌生理生化功能具有重要的调节作用。铜绿假单胞菌PAO1中存在参与c-di-GMP代谢的基因PA2072。【目的】探讨铜绿假单胞菌PAO1中c-di-GMP代谢相关基因PA2072的生物学功能。【方法】运用PCR及分子克隆技术构建PA2072基因及各结构域的自杀载体,运用基因敲除方法获取PA2072基因的3个突变株;利用泳动性(swimming)、蜂群运动(swarming)、蹭行运动(twitching)和生物膜定量实验对细菌进行初步的表型分析,进一步通过刚果红染色法对菌株进行分析。【结果】成功构建PA2072基因敲除突变菌株及回补菌株;生物膜定量结果发现基因PA2072的敲除会影响细菌生物膜的形成,PA2072蛋白的不同结构域对生物膜的合成也起到了重要作用;细菌运动能力检测中发现PA2072相关基因的敲除对细菌运动能力也有一定影响。刚果红平板检测结果显示,与野生型PAO1菌株相比,P...     

铜绿假单胞菌M18 rsmY突变株的构建及其对PCA和Plt的区别性调控

【目的】在假单胞菌中,小RNA(sRNA)参与初级和次级代谢产物、多种毒素因子以及菌群传感系统的调控,通过在植物根际促生铜绿假单胞菌M18中研究RsmY对吩嗪-1-羧酸(PCA)和藤黄绿菌素(Plt)两种抗生素的调控作用,深入了解假单胞菌中次级代谢的途径并为构建高产抗生素工程菌株提供了一定的理论基础。【方法】运用同源重组技术,构建了铜绿假单胞菌M18株的rsmY突变菌株M18RY,通过基因过表达、lacZ报告基因融合分析实验,进一步验证了RsmY对抗生素合成基因的调控作用。【结果】比较野生型M18和突变株M18RY中PCA和Plt在同一培养条件下的生物合成量,突变菌株M18RY中PCA的产量显著增加,为野生型菌株的5倍左右,而Plt的产量降为野生型的1/8。LacZ报告基因融合分析进一步证明了RsmY对PCA的负调控作用主要是通过phz2基因簇来实现的。【结论】结果表明,rsmY基因区别性调控PCA和Plt的生物合成。     

假单胞菌株M18中pqsA突变株的构建及其对plt的调控

【目的】根际铜绿假单胞菌M18能产生藤黄绿菌素(Plt)和吩嗪-1-羧酸(PCA)两种主要的抗生素。其PqsR/PQS群体感应系统由应答调控蛋白PqsR与信号分子PQS组成。前期研究已经表明pqsR负调控Plt生物合成及基因簇表达。本论文旨在研究PQS分子对Plt合成及基因表达的调控作用。【方法】从M18基因组中扩增PQS合成基因pqsA,通过同源重组技术构建假单胞菌M18的pqsA突变菌株M18pqsA。利用lacZ报告基因分析、信号分子添加实验等,研究PQS对Plt合成及基因表达的调控作用。【结果】在KMB培养基中,分别比较野生型菌株M18和突变菌株M18pqsA的Plt产量,突变菌株的Plt产量存在较小幅度的升高,约为野生型菌株的1.53倍。添加PQS对plt表达存在一定程度但不是很显著的负调控作用。【结论】PQS分子对Plt生物合成及基因表达存在部分负调控作用。     

海假交替单胞菌fliC-02330基因缺失影响生物被膜形成及厚壳贻贝幼虫附着变态

【背景】假交替单胞菌属是一种广泛分布于海洋环境的革兰氏阴性细菌,存在于海底沉积物中,能分泌大量的胞外产物形成海洋微生物被膜,从而诱导海洋无脊椎动物的附着。【目的】探究海假交替单胞菌鞭毛蛋白fliC基因对生物被膜形成及厚壳贻贝诱导活性的影响。【方法】通过基因敲除构建海假交替单胞菌fliC-02330基因缺失突变菌,研究突变菌和野生菌菌落形态、生物被膜形成能力、胞外物质以及对厚壳贻贝幼虫附着变态的诱导能力等的差异性。【结果】与野生菌相比,突变菌菌落表型出现褶皱,运动能力下降,形成被膜膜厚增加,以及对幼虫附着变态诱导活性下降。共聚焦扫描发现,fliC-02330基因缺失突变菌胞外多糖含量下降,而蛋白含量上升。【结论】海假交替单胞菌鞭毛蛋白fliC-02330基因缺失促进生物被膜形成,但抑制厚壳贻贝幼虫附着变态。本研究为探究细菌鞭毛蛋白基因与厚壳贻贝幼虫的作用机制,以及后续进一步探索微生物参与海洋无脊椎动物附着变态提供一定的理论依据。     

茄科作物青枯菌NADH脱氢酶F亚基在细胞运动和致病性中的功能研究

[目的]劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）在茄科作物上引起严重的细菌性青枯病,本研究旨在发掘青枯劳尔氏菌与致病相关的基因。[方法]利用Tn5转座子构建随机插入突变体,分析生物膜形成、细胞运动和致病性;对有表型变化的突变体,运用TAIL-PCR方法鉴定Tn5插入位点,确定所突变的基因。[结果]以模式菌株GMI000为出发菌,总共获得了400个突变体,其中2个突变体不能形成生物膜,在软琼脂平板上的运动能力下降;接种感病番茄植物,这2个突变体都不能引起萎焉症状。TAIL-PCR结果显示,2个突变体的Tn5插入位点都在NADH脱氢酶F亚基（nuoF）中,距离翻译起始位点分别为103-bp和225-bp。ripAY基因启动子推动的nuoF基因互补载体,完全恢复了2个突变体的表型。[结论]NADH脱氢酶复合物是微生物呼吸电子传递链中的第一步催化酶。我们的结果表明,NADH脱氢酶复合物对R.solanacearum生物膜形成、细胞运动和致病性也有重要作用。     

茎瘤固氮根瘤菌ORS571中motA基因的功能分析

[目的] MotA是细菌的鞭毛马达蛋白,是跨膜质子通道的重要组成结构之一,在调控鞭毛运动中具有至关重要的作用。本研究探究了Azorhizobium caulinodans ORS571中鞭毛马达基因motA对菌株表型和植物互作的影响。[方法] 通过同源重组原理和三亲接合转移方法构建突变菌株∆motA,测定野生型与突变体在菌体生长、运动、固氮、胞外多糖合成、生物膜形成及根系定殖能力的差异。[结果] 与野生型相比,突变体菌体生长没有明显差异,但其运动能力完全丧失,固氮、胞外多糖合成、生物膜形成及根系定殖能力减弱。[结论] MotA鞭毛马达蛋白对A.caulinodans ORS571的运动、固氮、胞外多糖合成、生物膜形成及根系定殖能力均有调控作用。     

双组分系统rcsC基因影响禽致病性大肠杆菌的致病性及相关生物学特性

【目的】双组分系统Rcs感受外界环境变化,并调控细菌的适应性及生存等。本文探讨Rcs双组分系统传感器激酶RcsC对禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)相关生物学特性及致病性的影响。【方法】采用Red同源重组的方法构建rcsC基因缺失株,并利用互补质粒构建互补株,然后比较野生株、基因缺失株与互补株的生长特性、运动性、生物被膜、凝集沉淀能力、致病力及毒力基因转录水平的差异。【结果】rcsC基因缺失不影响APEC的生长速度,然而,缺失RcsC导致APEC的运动能力升高、生物被膜形成能力降低和凝集能力增强。凝集试验结果显示rcsC基因有助于APEC的凝集沉降。细胞黏附入侵结果表明,rcsC在APEC侵袭DF-1细胞过程中发挥作用,而对黏附能力无影响。动物感染试验结果表明rcsC基因缺失能显著降低APEC的毒力。荧光定量PCR检测结果表明,rcsC基因缺失株中ompA、aatA、fyuA和luxS基因的转录水平均显著降低,而fimC和tsh基因的转录水平显著升高。【结论】RcsC参与调控APEC的运动性、生物被膜形成、凝集沉降和致病力。     

青枯雷尔氏菌胞外多糖合成缺失突变株构建及其生物学特性

【目的】由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的植物青枯病是一种毁灭性土传病害。胞外多糖(extracellular polysaccharides,EPS)是青枯雷尔氏菌关键的致病因子之一。通过构建胞外多糖缺失突变株,研究胞外多糖在青枯病致病中的作用。【方法】从青枯雷尔氏菌FJAT-91的基因组中克隆出胞外多糖合成结构基因epsD同源臂,克隆至自杀性质粒p K18mobsacB,再将庆大霉素抗性基因(Gm)插入同源臂中间,获得重组质粒p K18-epsD。将重组质粒转化至青枯雷尔氏菌FJAT-91感受态细胞中,通过同源重组敲除epsD基因,获得EPS合成缺失的突变株FJAT-91Δeps 。研究突变株与野生菌株在菌落形态、胞外多糖合成、运动能力、定殖能力的差异性。【结果】突变菌株FJAT-91ΔepsD与出发菌株FJAT-91相比:胞外多糖产量显著减少,生长较慢;泳动能力(swimming motility)和群集运动能力(swarming motility)显著降低;在番茄苗根部和茎部的定殖能力显著降低;弱化指数(AI)为0.905,鉴定为无致病力菌株。【结论】胞外多糖在青枯雷尔氏菌的致病中起着关键的作用,本课题研究成果为开发植物疫苗提供了优良的材料与研究基础。     

嗜水气单胞菌zntR调控的生理功能及其机制研究

【目的】ZntR是一种金属调控蛋白,可催化锌外排基因的转录激活,防止细胞内二价Zn离子过量,但其对细菌生理功能的影响目前尚不清楚。【方法】本研究构建了嗜水气单胞菌ATCC7966(Aeromonas hydrophila,A.h)的zntR缺失株及补救株,对菌株的生物被膜形成能力、溶血活性、运动能力和响应金属离子胁迫等生理表型进行评估。【结果】敲除zntR基因的菌株对锌和铬离子胁迫敏感、对钴离子胁迫耐受,并且生物被膜形成能力下降、运动能力增强,这些表型在其补救菌株中均能得到恢复。进一步利用DIA定量蛋白质组学技术比较野生株和zntR缺失株的蛋白表达差异,发现ZntR还可能参与双组分系统、细菌的趋化性等代谢通路的调控。【结论】该研究结果可为今后深入探讨zntR转录因子参与细菌生理功能的调控机制提供理论依据。     

毒力基因yqeH功能分析及对禽致病性大肠杆菌致病性的影响

【背景】禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)可引起禽类急性或亚急性感染,在近年新发现的大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2 (Escherichia coli type III secretion system 2,ETT2)中,毒力基因yqeH对其致病性的影响尚不明确。【目的】探究yqeH在APEC致病过程中的作用,为后期深入研究ETT2致病机制奠定基础。【方法】利用Red同源重组技术构建yqeH缺失株ΔyqeH及其回复株CΔyqeH,通过运动性、生物被膜形成能力、抗逆性、抗血清杀菌能力等试验分析yqeH对APEC生物学功能的影响,并通过细胞黏附、侵袭试验、致病力测定及荧光定量PCR检测细胞炎性因子转录水平,探究yqeH对APEC感染宿主的影响。【结果】构建了缺失株ΔyqeH和回复株CΔyqeH;生物学特性试验结果表明,与野生株APEC81相比,缺失株ΔyqeH生物被膜形成能力、运动能力降低,对酸、碱、渗透压、氧化休克的耐受力降低,抗血清杀菌能力及致病力显著降低;与野生株APEC81相比,缺失株ΔyqeH对鸡气管黏膜上皮细胞的黏附及侵袭能...     

低H~+_-ATPase活性植物乳杆菌突变菌筛选及基因表达的相对定量分析

【目的】筛选H~+_-ATPase活性降低的植物乳杆菌突变菌,比较其与亲本菌基因表达水平的差异,进一步探索H~+_-ATPase的调控机制。【方法】利用硫酸新霉素诱变、筛选突变菌,并对亲本菌(ZUST)和突变菌(ZUST-1、ZUST-2)进行生长、产酸能力及H~+_-ATPase活性的测定。分别提取亲本菌和突变菌的基因组DNA,扩增H~+_-ATPase全部编码基因并测序。通过荧光定量PCR对H~+_-ATPase全部编码基因进行相对定量分析。【结果】突变菌的生长和产酸能力均低于亲本菌,突变菌ZUST-1和ZUST-2的H~+_-ATPase活性比亲本菌分别降低了10.1%和28.8%。突变菌ZUST-1和ZUST-2的atp A基因均有22个位点发生突变,而ZUST-2的atp C基因有6个位点发生突变。突变菌ZUST-1和ZUST-2的atp A在对数期基因表达水平分别比亲本菌ZUST下调了41.1%和35.7%,在稳定期分别下调了43.6%和14.2%;ZUST-1的atp C基因在对数期的表达水平比ZUST略高,在稳定期比ZUST上调了30%,而ZUST-2的atp C基因未表达。【结论】突变菌H~+_-ATPase活性减弱会导致其全部编码基因在稳定期表达水平上调(除ZUST-2的atp C不表达外),而且atp A和atp C基因突变导致的基因表达水平的差异是影响H~+_-ATPase活性的主要因素,此研究结果为进一步研究植物乳杆菌中H~+_-ATPase的调控机制奠定了基础。     

信号分子AI-2合成关键基因luxS对副溶血性弧菌生物学特性的影响

[背景]副溶血性弧菌是全球范围重要的食源性病原菌,能引起急性肠胃炎。群体感应系统LuxS/AI-2影响细菌的生物学特性,为研究副溶血性弧菌的传播机制和控制技术提供了新的途径。[目的]探讨群体感应信号分子AI-2合成关键基因luxS对海产品中分离的副溶血性弧菌Vp2009027生物学特性的影响。[方法]利用自杀质粒同源重组技术敲除信号分子AI-2合成关键基因luxS,构建副溶血性弧菌Vp2009027的luxS基因缺失株,通过比较野生株与luxS基因缺失株的生长曲线、AI-2活性、运动能力、生物膜形成能力和耐药性,分析LuxS/AI-2系统对副溶血性弧菌生物学特性的影响。[结果]构建了副溶血性弧菌Vp2009027的luxS基因缺失株,野生株和luxS基因缺失株的生长无明显差异,luxS基因的缺失导致AI-2合成受阻、运动能力和生物膜形成能力增强、四环素耐药性降低。[结论]luxS基因对副溶血性弧菌的生物学特性具有重要的调控作用,为进一步研究副溶血性弧菌的传播机制和研发控制技术提供基础。