高产吲哚乙酸及高泌氨巴西固氨螺菌的筛选与鉴定

目的：从玉米根际和土壤中分离具有高产吲哚乙酸较强的泌氨能力的巴西固氮螺菌。方法：分别通过半固体NFb培养基、CR培养基、LB培养基分离培养固氮菌株,并经过一系列菌落菌体形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列测定等试验对其进行鉴定。结果：经分离纯化获得10株固氮菌,并鉴定均为巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）,其中菌株R7在甘油半固体培养基上能分泌约14mmol/L的氨,在添加了色氨酸的培养基中能够合成58.8μg/ml的吲哚-3-乙酸（IAA）。结论：成功筛选得到一株既高产吲哚乙酸又有较强的泌氨能力的巴西固氮螺菌。     

沙棘弗兰克氏菌的生物学特性研究

从辽宁省西部的沙棘(Hippophae rhamnoides L.)根瘤中分离到8株内生菌,它们都具有Frankia菌的典型形态特征。 回接鉴定表明,8株菌均可使寄主结瘤。各菌株的侵染能力不同;回接培养液的种类是影响侵染力的重要因素。分离于两个不同地区的菌株Frankia sp.Hr16和Hr32在GyA培养基上的培养特征有一定差异。实验菌株可利用多种碳源,其中丙酮酸盐是理想碳源。在以丙酮酸盐为唯一碳源,浓度为10mjlf的Bap培养基中,Hrl6菌株的对数期倍增时间可降至知小时,菌体在两周内达到最大生长量o Hrl6菌株的自生固氮活性亦受碳源的影响,在以5mM的丙酮酸盐的无氮Bap培养基中,其话性为176.5nmol. C2H4／mg蛋白/小时。     

固氮螺菌氢代谢与固氮作用的关系I.固氮螺菌放氢现象与吸氢能力的研究

本文研究了固氮螺菌(Azosptrillum brastlense)的放氢现象和吸氢酶活性以及与固氮作用的关系。测定了57株固氮螺菌的放氢现象及其固氮酶活性,其中不放氢41株,微放氢14株,其放氢量为2·63—31.00n mol C2H4／ml菌液·小时。放氢量较多的2株R38{和R256A都是从水稻根表上分离获得,其放氢量分别为185.75n mol H2／ml 菌液·小时和547．00 moIH2／ml 菌液·小时。测定了53株螺菌的吸氢酶活性,它们均具有吸氢能力,其吸氢量各异,0-63-27·38n mol H2／ml菌液。小时。生长在含有NH4CI培养基上的固氮螺菌既没有固氮能力,也不产氢。在无氮培养基上所产生的氢是固氮过程中放出的氢。实验结果指出,C2H2抑制氢酶的活性。当吸氢的菌株与放氢菌株混合培养时,其固氮酶活性比单株纯培养高,有氢存在时,固氮酶活性比不加氢时高。     

糖蜜草(Melinis minutiflora Beauv.)内生固氮菌分离鉴定

糖蜜草（Melinis minutiflora Beauv．）是热带地区的一种优良牧草。采用选择性培养基在厌氧和好氧两种培养条件下,从糖蜜草根、茎中都可分离得到具有较强固氮酶活性的菌株。通过SDS-PAGE全细胞蛋白电泳技术快速聚类分析表明,来源于糖蜜草中的菌株为同一类群。16S rDNA序列分析和总DNA的G＋c％含量进一步确定糖蜜草中所分离的菌株属于固氮螺菌属（Azospirillum）,与产脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum）亲缘关系较近。BIOLOG板测定结果显示,糖蜜草菌株TMCY243对多种碳源具有很强的适应性,与产脂固氮螺菌（A．lipoferum）的模式菌株DSM 1691存在着较大的差异。以上结果表明,糖蜜草内生固氮菌为固氮螺菌属的一个新类群。     

固氮螺菌耐高铵突变株的生物学特性

本文报道9株固氮螺菌耐铵突变株,在培养基中有30—120m mol/L NH₄⁺存在时,具有强弱不等的固氮酶活性。而出发菌株在有微量NH_4~+存在时,固氮酶活性完全被抑制。耐铵突变株的其它特性与出发菌株相似。     

玉米根系联合固氮细菌的研究

从我国湖北省武汉市和广西南宁市的禾本科作物的根系上,分离获得一批具有固氮酶活性的菌株,并对其中99菌株和224菌株进行了鉴定及其联合固氮特性的研究。两株菌的主要特点是：革兰氏染色阴性;短杆状;单极单生鞭毛;能运动;在无氮的苹果酸盐培养基上生长5—7天,有一个到一个半螺旋的菌体出现;菌体内含折光脂肪滴;过氧化氢酶为正反应;V.P.反应以及吲嗓反应为负反应;最适生长与固氮的温度为32℃：最适pH值为6．5—7．0;在玉米的根系上能形成联合固氮。根据其形态特征和生理生化反应,鉴定为含脂刚螺菌(Sptrillum lipoferum)。据盆载回接试验证实,玉米根系与含脂刚螺菌可形成联合固氮。将采集的根样,经预培过夜,其固氮酶活力可达600一1100乙烯毫微克分子／克干根／小时,若不加诱导即测不出酶活。     

固氮螺菌耐高铵突变株的选育

应用亚硝基脏(N-nitrosoguanidine,NTG)诱变剂对固氮螺菌菌株Ma241、Ma99、Sp7和G14进行诱变处理后,在掭加了铵的类似物乙撑二胺(ethyleae diamina)的D6bcreiner无氯培养基中进行筛选．反复纯化,获得了在4 5 n、M NH}浓度以上,保持固氯酶活性的耐铵突变株共9株。突变株22的耐铵固氮酶活性最强,在75mM NH+4浓度下,固氮酶活性达到464n mol乙烯／mg蛋白·小时,在200m M NH+4浓度下,固氯酶话性仍有32nmol/mg蛋白·小时。     

西双版纳保护区植物根际细菌的筛选及其促生能力研究

【背景】西双版纳保护区具有丰富的生物多样性,而该区域植物根际细菌特别是放线菌及其促生能力相关报道较少。【目的】从西双版纳保护区根际土壤中筛选出植物根际促生菌,并检测其促生能力。【方法】采用5种不同培养基筛选出植物根际促生菌并通过16S rDNA序列分析进行分类学鉴定,运用Salkowski法测定菌株产IAA的能力,CAS法测定菌株产铁载体能力,钼锑抗显色法测定菌株的解磷能力,CMC-Na法测定菌株产纤维素酶能力和改良的Young法测定产淀粉酶能力,综合评价所得菌株的促生能力。【结果】从土样中分离纯化得到14株典型促生菌,经鉴定分别归属于链霉菌属(Streptomyces)、诺卡菌属(Nocardi)、杆菌属(Bacillus)、中华根瘤菌属(Ensifer)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、固氮螺菌属(Azospirillum)和狭单胞菌属(Stenotrophomonas)。其中菌株B433产吲哚乙酸的能力在培养12 d时达到最大值9.23 mg/L;菌株B351、B453、B546这3株菌株产铁载体的能力较强,其Su80%,最高可达86.67%,强度为+++++;菌株B541的解磷能力最强,磷酸根的浓度达到9.79 mg/L;菌株B442综合产纤维素酶能力最强为31.86 U/mL;菌株B412淀粉酶活力为16.07 U/mL。【结论】西双版纳保护区植物根际土壤促生细菌种类丰富,且具有较强的广谱促生能力,有潜在的开发价值,本研究可为此地的微生物资源开发提供可靠的菌株资源依据。     

稻根联合固氮细菌的研究II．粪产碱菌A-15和阴沟肠杆菌E-26的固氮特性

用乙炔还原法、总氮测定法和15N同位素示踪法证实了从水稻根分离的两株固氮菌,粪产碱菌(Alcaligenes faecalis) A-15和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae) E-26,具有较强的固氮 能力。A一15是徽好氧固氮菌,利用苹果酸、乳酸、琥珀酸等有机酸作为碳源,在无氮的半固体培养基中生长和固氮良好,乙炔还原活性可达500—700毫克分子C2H·／毫升培养物／小时。E一26是兼性厌氧菌,只有在严格厌氧条件下才有较明显而又稳定的固氮能力。在无氮的蔗糖培养基中,乙炔还原活性为200一如0毫克分子ctH·／毫升培养物川、时,当A一15和E一26混合培养时,两菌表现出协同的固氮作用,周氮量剧增,乙炔还原活性可提高至1000一1500毫克分子 C2H4／毫升培养物／小时。     

茎瘤固氮根瘤菌甲基化受体蛋白Tlp1的功能

【目的】考察茎瘤固氮根瘤菌中趋化基因簇上游的受体蛋白Tlp1编码基因的突变表型,初步探究其功能机理。【方法】利用同源重组和三亲本接合转移的方法构建突变株,在TY培养基中测定生长情况,半固体平板法观察趋化圈,刚果红固体培养基观察胞外多糖和次生代谢产物的分泌,乙炔还原法测定菌株的固氮酶活性。【结果】与野生型菌株相比,tlp1突变株的生长速率没有影响。在以甘油为碳源的L3半固体平板上突变株的趋化圈变小,其回补菌株能部分回补趋化能力。突变株的胞外多糖分泌与野生型没有区别,但其次生代谢产物黑色素出现的时间比野生型稍早。在固氮酶活性测定中,发现突变株酶活性明显比野生型降低,回补菌株能够部分回补。【结论】茎瘤固氮根瘤菌Tlp1蛋白对甘油表现出一定的趋化能力,并且影响细菌的次生代谢产物和固氮能力。     

花生根际多功能固氮菌的分离及其耐盐碱特性研究

旨在获得具有固氮、溶磷及分泌IAA的多功能耐盐碱根际促生菌(PGPR),提高盐碱地花生产量。采用平板涂布法对盐碱地花生根际固氮菌进行了分离,结合16S rDNA序列鉴定和乙炔还原法测定固氮酶活。共获得22个固氮菌株,其固氮酶活性为125.82-346.32 nmol C_2H_4/(h·mL)。所有菌株均具有产ACC脱氨酶及溶解难溶性磷源活性。其ACC脱氨酶活性为0.12-1.26U/mg;溶解磷酸三钙量为1.45-53.58 mg/L,溶解磷酸铁量为1.45-8.27 mg/L,溶解磷酸铝量为1.1-22.82 mg/L。其中,10株具有分泌IAA的能力,分泌量在1.36-17.80μg/mL,占供试菌株的55%。对这10株促生菌进行NaCl、pH耐受性测定,结果显示最大pH耐受力为9,最大NaCl耐受力为1.5 mol/L。这10菌株具有较强的耐盐碱性,具有在盐碱地中应用的潜力。     

转座子Tn916对固氮螺菌Azospirillum brasilense的接合诱变及氨分泌菌株的筛选

以携带质粒pAM120(Ap~r,Tc~r/Tn916)的大肠杆菌(E.coli CG120)为供体菌株,与受体菌巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)采用滤膜接合法进行接合转移,在选择平板上得到具较高频率的接合子(10~(-5)/每个供体菌,选择四环素抗性)。从846株四环素抗性接合子中进一步用奈氏法筛选得到氨分泌突变株3株。在无氮培养基上,其氨分泌量可达7.5～14.0mmol/L。用乙炔还原法分析氨分泌突变株在不同浓度氮源上的固氮活力,发现20mmol/L NH Cl的存在不抑制其固氮活性,固氮活力与无氮条件下野生株的活力相差不多。无选择压力下细胞分裂50代后的稳定性实验证明,转座子Tn916在氨分泌突变株中的稳定性在50％～80％之间。以固氮螺菌氨分泌突变株为供体菌株,对E.coli HBX1进行反向接合转移实验,证实Tn916确实存在于氨分泌固氮螺菌接合子中。     

Frankia sp．Asll和EaI827菌株的固氮研究

由辽东桤木和沙枣的根瘤中分离出两株内生菌(Frankia sp.),分别编号为Asll和EaI827。可在丙酸作碳源的限定培养基中诱导出泡囊,并表现较高固氮活性。不同浓度的NHt和水解酪蛋白对菌体的生长有促进作用,而对固氮活性却表现出明显的抑制作用。当氧分压为5％时,Asll菌株固氮活性较高,而F~1827菌株最适氧分压为1％。Asll菌株的固氮周期为8一11天,Eai827菌株在11一14天表现出较高的固氮活性。     

海藻糖产生菌的筛选及其发酵条件研究

通过液体发酵筛选,从土壤中分离的241株菌株及保藏的95株菌株中得到15株海藻糖生产菌,对这些菌株进一步筛选得到产海藻糖最多的一株菌Bacillus sp。其发酵最适合条件为：以麦芽糖为碳源,发酵初始pH值7.0,接种量为6%,30℃条件下培养48h,另外该菌株在分别以葡萄糖和蔗糖为碳源的培养基中都能产生海藻糖。     

紫外诱变原生质体选育D-核糖生产菌株

以D-核糖产生菌枯草芽孢杆(Bacillus subtilis)B941为出发菌株,采用紫外诱变原生质体的方法,获得了4株可以在含有6．0％D-核糖的培养基上生长的D-核糖高产菌株,其摇瓶发酵产糖达55．0g／L左右。通过摇瓶发酵试验,研究了D-核糖高产菌株Buvp-24的遗传稳定性。研究结果表明,经多次传代,菌株Buvp-24的发酵产糖能力及对发酵产物D-核糖的耐受性没有改变,有望应用于工业生产中。     

一株多菌灵高效降解菌的分离鉴定及特性

从长期施用多菌灵农药的葡萄园中分离筛选得到一株多菌灵降解菌XJ-H,经Biolog微生物自动分析系统和16S rDNA序列比对以及系统聚类分析等鉴定菌株XJ-H为巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense).多菌灵降解菌XJ-H可利用多菌灵为唯一碳源、氮源进行生长,将其接种在600 mg·L-1多菌灵的无机盐培养基中,11d时多菌灵的降解率达到95.6%,平均降解能力为52.2 mg·L-1·d-1.     

藤县药用野生稻内生固氮菌分离鉴定及系统发育分析

从广西梧州市藤县药用野生稻中筛选内生固氮菌,为微生物肥料生产收集菌种资源。采用3种无氮培养基经平板划线法筛选内生固氮菌;通过乙炔还原法测定其固氮酶活性;利用IS-PCR(Insertion sequence-based PCR)指纹图谱和全细胞蛋白电泳图谱对获得的内生固氮菌进行聚类分析;根据16S r RNA基因序列分析确定其进化关系;使用分光光度计比色法检测其产生长素能力、产铁载体能力、溶磷能力和ACC脱氨酶活性。结果显示,从野生稻中筛选获得34株内生固氮菌分为5个类群,类群I和II各有8株,类群III、IV、V分别有2株、5株和11株,其固氮酶活性介于5.0和1 036.7 nmol/(m L·h)之间。类群I代表菌株HU33与无乳固氮螺菌(Azospirillum amazonense ATCC 35119T)相似性为97.13%;类群II代表菌株HU31与变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola DSM 15968T)相似性为99.71%;类群III代表菌株HU17与蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii ATCC 700476T)相似性为99.86%;类群IV代表菌株HU13与黄黄色杆菌(Xanthobacter flavus ATCC 35867T)相似性为100%;类群V代表菌株CM05与越南伯克霍尔德菌(Burkholderia vietnamiensis LMG 10929T)相似性为99.86%。药用野生稻内生固氮菌资源具有遗传多样性;有些菌株有较强的产生长素、产铁载体、ACC脱氨酶活性和溶磷能力,在农业生产上具有一定的应用潜力;类群I可能是一个新类群。     

产几丁质酶褐色喜热裂孢菌的分离鉴定及产酶特性初步研究

采用选择性培养基从土壤中分离到1株产几丁质酶的微生物菌株YX,经形态和分子鉴定为褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)。进一步在摇瓶中比较了T.fusca YX在纤维二糖、几丁质、或羧甲基纤维素钠为碳源的培养基中的产酶特性,YX菌株在5 L发酵罐中以几丁质为碳源的培养基发酵到22 h左右时发酵液几丁质酶活即可达到1.7 U/m L。本文首次报道褐色喜热裂孢菌能够产生几丁质酶,具有潜在的应用价值。     

三种荒漠灌木根际可培养固氮细菌类群及其固氮和产铁载体能力

【目的】揭示西鄂尔多斯荒漠孑遗灌木四合木(Tetraena mongolica)、沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)、白刺(Nitraria tangutorum)根际可培养固氮细菌类群,分析固氮酶活性和产铁载体能力,以期为认识和利用荒漠植物根际促生细菌提供依据。【方法】以Ashby无氮培养基、采用涂布划线法分离纯化根际固氮细菌;基于16S r RNA基因分析类群组成;以乙炔还原方法测定固氮酶活性;以铬天青S蓝色平板定性筛选产铁载体菌株,以分光光度计法定量产铁载体能力。【结果】共分离出固氮细菌22株,分别属于3个门与9个属,其中变形菌门(Proteobacteria,82%)为绝对优势门,假单胞菌属(Pseudomonas,27.27%)为优势属;Rhizobium和Bacillus分别是沙冬青和四合木的独有属,而白刺独有属有Enterobacter、Stenotrophomonas和Paenibacillus;10株在无氮培养基上生长迅速,它们的固氮酶活性在871.71-3 383.09 nmol C2H4/(H·Culture)之间,并且其中有7株具有产铁载体能力,其产铁载体的As/Ar值范围为0.35-0.79。【结论】鄂尔多斯荒漠珍稀孑遗灌木植物根际固氮细菌类群多样,植物间差异明显,包含多种高固氮酶活性和产铁载体能力的固氮细菌,可作为植物生长促进根际细菌的重要来源。     

土壤杆菌固氮生理特性研究

对根癌土壤杆菌C58/pGV3850菌株的固氮生理特性研究结果表明,该菌具有自生固氮活性,其固氮活性的最适pH为8.0,温度为30℃.固氮活性在对数生长后期(14h)最高,延缓期和静止期乙炔还原活性较低.该菌株好氧,通过氧呼吸和吸氢酶的作用达到避氧固氮.当通入氧气超过呼吸耗氧时,对固氮活性产生抑制作用.在培养过程中增加NH_4~+浓度,固氮活性会降低,当达到15mmol/L时完全丧失固氮活性,表现NH_4~+阻遏固氮酶蛋白合成.在乙炔还原测定系统中加入NH_4~+并不影响乙炔还原反应,说明没有NH_4~+关闭现象.培养过程中加入MSX(2.5mg/ml)能解除10mmol/L NH_4~+对固氮酶合成的阻遏作用.固定的游离氮不能以NH_4~+形式分泌于胞外.固氮过程中放出大量氢气,培养16小时产氢量达65μmol H_2/mg蛋白.在限碳条件下(0.2%蔗糖)其吸氢酶活力可达520nmol H_2·ml~(-1)·h~(-1).