药用中性蛋白酶的研究

枯草杆菌(Baceillus subtilis) AS 1.398中性蛋白酶的粗酶(5万u／g),用自来水(1：10)抽提12小时,在这抽提液中加入20％(v／v)CaCl2溶液(在100ml水中加60g无水CaCl2)：再加25％固体硫酸铵使酶沉淀,过滤后得酶饼,用0．005MpH7．2磷酸缓冲液溶解,经Sephadex G-25柱脱盐,冷冻干燥得片状粉末,含酶活60一100万u/g,纯度提高4倍,本制剂具有较强的抗炎消肿及溶解纤维蛋白的作用。     

二性霉素B与β-escin混合穿孔电极液在人心房肌细胞SK2电流记录中的应用

目的:为研究钙离子对人心房肌细胞小电导钙激活钾通道电流(ISK2)的调节作用,建立用二性霉素B(amphotericin B)与β-escin穿孔的膜片钳(PPR)技术。方法:体外循环术中取得右心耳,应用急性酶分离获得单个人体心房肌细胞,用二性霉素B和/或β-escin作为穿孔电极液,进行穿孔膜片钳实验,在此模式下测试钙离子对人心房肌细胞SK2电流的调控作用,并用胞内钙测试系统验证穿孔前后胞内钙变化。结果:混合使用穿孔电极液6.88μg/mlβ-escin和150μg/ml二性霉素B与单独用150μg/ml二性霉素B或6.88μg/mlβ-escin相比,前一种方法细胞容易封接,能形成稳定的穿孔膜片钳记录模式,可观察到SK2电流有激活,且胞内钙测试系统检测时可观察到穿孔后电极液至细胞内的游离钙离子浓度的增加,F340/380增强。结论:适当浓度的二性霉素B与β-escin混合使用进行穿孔膜片钳实验是一种稳定的全细胞膜片的记录技术,可以用于胞内游离钙离子对SK2电流调控的研究。     

变色素2R水溶液显示神经髓鞘的新方法

本文应用变色素 2R(Chromotrope 2R)显示神经髓鞘的新方法,将神经髓鞘染成红色,形态清晰,颜色鲜艳,操作简便,易于掌握,是显示神经髓鞘较为优良的方法,为神经组织的病理诊断和研究提供了新的技术方法.标本来源:尸检脑组织、脊髓和周围神经组织,经10%甲醛固定,石蜡包埋,切片5μm.试剂的配制:①变色素2R染液:变色素2R(北京化工厂)0.5g,磷钨酸0.6g,冰醋酸1.0g,蒸馏水加至100ml.放置4℃冰箱长期保存,用前回温.②0.2%冰醋酸水溶液:冰醋酸0.2ml,蒸馏水加到100ml.染色步骤:     

介绍一种简便快捷的网状纤维染色法

为了提高病理诊断的阳性率 ,提高网状纤维染色质量及速度 ,减少误诊现象。我们经过反复试验多次摸索 ,网状纤维加温染色法获得了满意的效果。本方法从原来的一个小时缩短到三十五分钟至四十分钟之间 ,即稳定又可靠 ,现将此方法介绍如下。材料和方法1.材料　试剂购自上海虹桥试剂研究所 ,氨银液由技术人员自己配制。二氨银液的配制 (10 %硝酸银、3%氢氧化钠、氨水均购自上海虹桥医用试剂研究所 )一滴一滴加氨水至硝酸银液中直到沉淀不能完全溶解为止 ,再加入氢氧化钠。为使沉淀再溶解在溶液内 ,再一滴一滴地加氨水到仅有微量乳白色为止。加玻…     

塑料孔板原位免疫细胞化学、免疫荧光、特染方法的建立

细胞免疫化学、细胞各种特殊染色是我们常用的科研实验方法。常用的是盖玻片爬片染色法[1,2,3],此方法在研究工作中,操作繁琐、片薄易碎、去污不彻底、背景时常不洁净、细胞分布不均易脱落,影响了照片的清晰度。因此,我们一直摸索用塑料孔板原位染色代替盖玻片爬片染色,经过反复实验研究,解决了塑料孔板染色中的固定剂和封片剂两大难题,大大简化了操作过程,提高了染色的质量和实验结果的准确性。现将此方法介绍如下:材料和方法1.材料24孔培养板或6孔培养板4%多聚甲醛配制:4g多聚甲醛溶于PBS中,定容到100ml,存放在密闭容器中,65℃水浴中溶解,溶液4℃保存,两周内使用。封片剂配制:明胶7g溶于蒸馏水25ml温箱溶解,甘油35ml加蒸馏水40ml再加石碳酸0.25mg,二者混匀后温箱加热过滤。2.方法铺板:取对数生长期的细胞,经0.25%胰酶消化制成细胞悬液,计数24孔板铺2×104/ml细胞,6孔培养板2×105/ml细胞。根据孔底面积大小的不同,铺的细胞数也不同,一般以生长2-3d,空白比为50%为好,太稀、太密细胞形态不能充分展现。固定:加培养液2-3d,吸出培养液,用PBS洗一遍,加入4%多聚甲醛1-2ml,固定...     

饲料中黄曲霉毒素B1、G1和棕曲霉毒紊A的薄层层析测定法

饲料样品25g,用100 ml乙睛:4%氯化钠溶液(9:1)抽提,吸取25 ml提取液,以石油醚脱脂二次,加0.1mol/L碳酸氢钠溶液12.5ml后,用氯仿提取二次,氯仿层放入蒸发皿中,于60℃水浴挥干,残渣以苯乙睛溶解定容为1ml,供测定黄曲霉毒素B₁、 G₁。碳酸氢钠水层中加1mol/L盐酸1ml左右调节pH值为4-5,再以氯仿提取二次,氯仿层放人蒸发皿中,于60℃水浴挥干,残渣以苯乙酸溶解定容至1ml,供测定棕曲霉毒素A。黄曲霉毒素B₁、 G₁的薄层板以乙醚横展、丙酮氯仿纵展。棕曲霉毒素A的薄层板以丙酮氯仿横展,甲苯乙酸乙醋90%甲酸纵展。展板后分别在波长为365nm和254nm的紫外光下观察。如为阳性样品,标记后用薄层扫描仪定量。棕曲霉毒素A阳性样品应先喷碳酸氢钠乙醇溶液后再扫描。本测定方法对三种毒素的最低检出量均为0.2ng/点,最低检出狠量均为3.2ppb。     

革兰氏染色三步法与质量控制

革兰氏染色(Gram stain),是细菌学中一个经常使用和十分重要的方法,自从1884年微生物学家Gram氏发明著名的革兰氏染色法以后,100多年来虽然经过后来学者的几次改进,但都仍然沿用着Gram氏原来的四步法,基本原理也没有改变。最近Allen氏对Ziehl-Neelsen抗酸菌染色法的改进,是一个良好的启示,使我们开始了革兰氏染色三步法的研究并取得了成功。现将我们建立的革兰氏染色三步法与质量控制报告如下。 1 材料和方法 1.1 结晶紫染色液 甲液:结晶紫2g;95％乙醇20ml。 乙液:草酸铵0.8g;蒸馏水80ml。 甲乙二液先分别溶解,然后混合在一起,过滤除去残渣后装入滴瓶中备用。     

常用凝胶电泳缓冲液配制

(一) Tris-醋酸(TAE) 0.04M Tris-醋酸, 0.002M EDTA 配制五十倍贮存液1升 Tris碱 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5M EDTA(pH8.0) 100ml Tris-磷酸(TPE) 0.08M Tris-磷酸, 0.008M EDTA 配制十倍贮存液1升 Tris碱 10 108g 85%磷酸(比重1.679mg/ml) 15.1ml     

温特曲霉转富马酸为L-苹果酸的初步研究*

从大量霉菌中选育到一株具有较高富马酸酶活性的温特曲霉(Aspergillus wentii) A5-61。在摇瓶培养条件下,32℃ 96小时,产L-苹果酸达10.49g/100ml,对富马酸的转化率达90.80%。利用菌体细胞,进行酶转化试验,结果表明：1.6g湿菌体接入25ml含富马酸10.0%（用NaOH中和至pH7.0）的转化液中,35℃16～24小时,连续转化三次,分别产生L—苹果酸9.61g/100ml、9.73g/100ml、6.93g/100ml。对菌体整体细胞酶学性质的研究表明,其最适反应温度35℃,最适反应pH7.0,Cu2＋对该酶有明显的抑制作用,该酶的Km＝0.154mol/L,Vmax＝0.0571mol/L·h。     

分离和鉴别脑膜炎球菌的培养基

一般认为脑膜炎球菌必须在含有天然动物蛋白(血液、血清、腹水及鸡蛋)的培养基上才能生长。而我们用黄豆代替动物蛋白用于脑膜炎球菌培养和鉴别,结果满意。培养基制备方法分离用培养基(黄豆—玉米淀粉抗菌素培养基):(1)基础培养基(g):胰胨6、胨6、牛肉膏3、氯化钠3、葡萄糖1、琼脂25、蒸馏水800ml,加热溶化。(2)玉米淀粉液:玉米淀粉3g(或玉米粉5g),用10ml蒸馏水拌成糊状,再用90ml煮沸的蒸馏水边倒边搅拌,微     

团头鲂九项血液学指标的正常值

本文对团头鲂九项血液学指标的正常值进行了研究。这九项指标是:RBC、ESR、Ht、Hb、PTP、PGC、MCV、MCH、MCHC。本文用三种方法,分布估计法溶许区间法和正态区间估计法,对正常值区间进行了估计,其中分布估计法因区间范围窄,因而结论较为可靠。根据这一方法所得出的九项血液学指标正常值区间是:185.30×10~4个/mm~3—274.95×10~个/mm~3(RBC),0.08mm/小时—1.25 mm/小时(ESR)、36.80％—68.84％(Ht)、4.46g/100ml—9.87g/100ml(Hb)、2.69g/100ml—5.98g/100ml(PTP)、91.47mg/100ml—301.85mg/100ml(PGC)、158.80μ~3—299.45μ~3(MCV)、20.67Pg—42.81Pg(MCH)、9.29％—21.24％(MCHC)。在具体条件下判定血液指标值是否属正常时,还应考虑生长和水温不同带来的差异。     

用家蝇幼虫神经节作染色体压片

家蝇（Muscadomestica）在我国广泛存在,它是一种主要卫生昆虫,能传染霍乱、伤寒及痢疾等疾病,但它也是一种很好的遗传学实验材料。本文推荐一种用于实验室饲养家蝇的方法,展示普通光学显微镜下所见的家蝇幼虫神经节细胞的染色体中期分裂期。达到取材方便,容易剥离标本,成功率高的效果。1家蝇的饲养（1）培养基成分玉米粉15g、红糖2g、蛋白陈5g、牛肉膏2g、酵母膏0．5g、苯甲酸15g、琼脂0．4g、自来水100ml。（2）培养方法用少许苯甲酸加无水乙醇溶解后,再加入培养基中,培养基煮熟smin后,分装干50Oml或1000ml已灭菌的广D瓶内,培…     

高效液相色谱法测定注射用盐酸吉西他滨含量测定

目的:建立高效液相色谱法测定注射用盐酸吉西他滨的含量。方法:采用高效液相色谱法,色谱柱:Aglea Venusil XBP C8 4.6×250mm 5um;流动相:以醋酸铵缓冲液(取醋酸铵3.85g加水800ml使溶解,加冰醋酸调p H值至5.7,加水1000ml)-甲醇(90:10)为流动相,检测波长268nm。结果:盐酸吉西他滨线性为y=944.25x+4608.5,r=0.9998,溶液在70.64 ng/ml~131.20ng/ml的浓度范围内线性关系良好;平均回收率为99.89%,RSD为0.53%(n=9),重复性RSD=0.12%(n=6);结论:该方法简便,线性、重复性好、准确度高,采用此方法能准确测定注射用盐酸吉西他滨含量。     

化湿液对湿阻证大鼠下丘脑AchE、NOS活性及NO含量的影响

目的研究化湿液对湿阻证模型大鼠下丘脑AchE、NOS活性及NO含量的影响。方法将50只SD大鼠随机分为正常组、模型组及模型组 化湿液低、中、高剂量组,每组10只。除正常组外,其余4组用改进后的环境加疲劳法制造湿阻证模型,连续造模6d。造模成功后,正常组和模型组大鼠按2ml/100g的剂量灌胃给予生理盐水;化湿液低、中、高剂量组分别按含生药0.4g/100g、0.8g/100g、1.6g/100g的剂量灌胃给予化湿液。每天1次,连续8d。取大鼠下丘脑,检测下丘脑AchE、NOS活性及NO含量。结果与正常组比较,模型组大鼠下丘脑AchE活性明显升高,NOS活性及NO含量明显降低(P<0.05);与模型组比较,化湿液可降低湿阻证模型大鼠下丘脑AchE的活性,提高下丘脑NOS活性及NO含量(P<0.05)。结论化湿液具有改善湿阻证大鼠下丘脑AchE、NOS活性及NO含量的作用,对研究化湿液治疗湿阻证的机制有一定价值。     

微波辐射取代氧化剂配制苏木素法

传统配制苏木素染液均以火加热,用有剧毒的氧化汞作为氧化剂。常常使液体外溢,氧化程度难以控制,有效使用时间缩短。我们经过多次实验,采用微波辐射代替氧化汞促进氧化苏木素取得了满意的结果,现介绍如下: 染液的配制:甲液:苏木素0.5g,无水酒精5ml;乙液:铵明矾10g,蒸馏水100ml。取乙液经医用微波仪(浙江临安电子器材产品,TWY781型)2档辐射2min,甲液微波5档辐射2min,然后将甲液、乙液混合,4档辐射10～15min,迅速放入冷水中冷却,最后加入2％冰醋酸即可使用。     

DDAH/ADMA通路在HDL促进内皮细胞NO生成中的作用

目的:观察高密度脂蛋白(HDL)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)抑制内皮细胞一氧化氮(NO)生成的保护作用,并探讨其与二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)/非对称性二甲基精氨酸(ADMA)通路的关系.方法:Ox-LDL(1000 g/ml)孵育人脐静脉内皮细胞(HUVECs)24小时或不同浓度的HDL(10、50、100μ g/ml)预处理HUVECs细胞1小时,再与ox-LDL(100μ g/ml)共孵育细胞24小时,收集细胞培养上清液检测NO、ADMA的浓度,收集内皮细胞检测DDAH-Ⅱ的mRNA和蛋白表达以及DDAH的活性.结果:Ox-LDL(100μ g/ml)孵育HUVECs24小时后,细胞培养上清液中NO的浓度显著降低,ADMA水平显著增高,细胞内DDAH-Ⅱ的mRNA和蛋白表达以及DDAH的活性均显著降低.HDL(10、50、100μ g/ml)可以拮抗ox-LDL(100μ g/ml)的上述作用.结论:HDL能显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞NO产生减少,其保护作用与其调节DDAH/ADMA通路有关.     

植物完整胚囊制片方法的改进——组织浸渍法分离、孚尔根法染色

本文乃介绍苏联等的方法。(见苏联植物学杂志,1978,6)。用野生禾本科植物如极地早熟禾(Poa arctica)、高山看麦娘(Alopecurus alpinus)等为材料,用FAA——市售福尔马林5ml、50％酒精90ml、冰醋酸5ml作固定液固定。固定后将材料洗净存放在70％酒精中。由于胚囊不太大(0.8mm),用手直接从野生禾本科植物的胚珠中取它们显然是不可能的,所以需用细胞溶解酶的组织浸渍方法才能把它们取出。这种细胞溶解酶是通过解剖萄葡藤上的蜗牛,切开胃从其液汁中收集、过滤得到的,并要在冰箱中冰冻状态贮存。     

一种半永久玻片标本的制备方法

这里介绍一种用蔗糖液制备半永久玻片标本的方法。用这种蔗糖液制备半永久玻片标本研究染色体是很方便的和有实际意义的。这种用蔗糖液制备的半永久玻片标本,可以保存较长时间(一年或更长)。蔗糖液的制备方法取40克蔗糖(化学纯)溶解在60毫升水中,并加热至沸,直至溶液总体积减少了1/4时为止。为避免蔗糖液冷却后出现结晶,要向蔗糖液滴入2—3滴香柏油,细心搅匀,然后再加0.2克苯酚结晶,该糖液可保存一个月以上。花药制片方法 1.从经卡诺固定剂(95％酒精:冰醋酸3:1)固定的保存在70％酒精中的花序上取出一些花药,用醋酸地衣红色液(醋酸洋红、醋酸间     

氧氟沙星擦拭残留方法学研究

目的:用于证实氧氟沙星擦拭残留量限度为2μg/ml时的检验方法的正确性及可靠性。方法:称取氧氟沙星适量,加0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成氧氟沙星母液,临用前稀释成需要的浓度,采用高效液相色谱法为检测分析方法,以确认检测方法能够符合要求。结论:本方法适用于氧氟沙星擦拭残留的测试。     

MTT法评价医用骨科材料的细胞毒性

目的:评价三种常用医用骨科材料的细胞毒性。方法:通过制备表面阳极氧化钛合金(Ti-6Al-4V)材料、聚醚醚酮(PEEK)材料和β-磷酸三钙(β-TCP)材料的浸提液与L929细胞接触,进行MTT试验。结果:所有样品浸提液的细胞相对增殖率(RGR)均≥80%,细胞毒性反应分级为0至1级。结论:这三类材料的0.2g/ml浸提液均显示无明显的细胞毒性。