用于检测葡萄球菌肠毒素的免疫芯片技术

免疫芯片是指包被在固相载体上的高密度抗原或抗体微点阵 ,是继基因芯片之后提出的一种新型的生物芯片。在检测大分子物质葡萄球菌肠毒素 (SE)时采用双抗体夹心法。检测时将SEA、SEB、SEC加入反应池中 ,反应后清洗掉未结合的SE ,再加入相应的标记抗体 ,形成固定抗体 待测物 标记抗体的夹心式结构。对影响免疫芯片检测效果的条件进行了优化 ,按优化后的条件进行SEA、SEB、SEC的检测 ,结果表明荧光信号强度随待测物浓度的增加而增加 ,当浓度高于一定值时 ,荧光信号强度趋于一定值 ,本法最低可检测 0.0 1 μg ml的SEA和SEB及 0.1 μg ml的SEC。将此项技术应用于环境和食品中污染物检测领域 ,将会使卫生监督工作水平得到明显的提高。     

重金属汞螯合物人工抗原的合成与鉴定

以异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸为双功能螯合剂,合成了半抗原,并将半抗原与钥孔戚血蓝素或牛血清白蛋白偶联制备抗原。用二喹啉甲酸(BCA)法测抗原浓度,对半抗原、抗原、KLH和BSA分别进行紫外分光光度计扫描, 利用SDS-PAGE电泳进行定性鉴定,用三硝基苯磺酸法间接测偶联率,用石墨炉原子分光吸收法检测抗原中Hg2+的含量。研究结果表明抗原合成成功, Hg-ITCBE-KLH、Hg-ITCBE-BSA、ITCBE-BSA中载体蛋白ε-氨基的替换程度依次为34.75±4.60％、40.61±0.99％、61.27±0.69％, Hg2+的含量依次为分：38.4±0.5μg/ml、125.5±0.9μg/ml、0μg/ml。     

霍乱疫苗中残余霍乱毒素检测方法的建立及验证

采用间接酶联免疫法,即用神经节苷脂包被,加入待检样品,再加入兔抗霍乱毒素B亚单位抗体,用标准样品的吸光值(A值)对标准样品的浓度绘制4-参数拟合曲线,根据标准曲线计算出待测样品中的CT浓度。结果显示,在浓度范围(0.6～16)ng/ml之间,CT标准浓度和检测浓度成线性关系,r2=0.9986。精确度在浓度范围(0.6～16)ng/ml,CT的平均回收率在96.24%～114.44%之间。精密度:批内变异CV%≤12.98%,批间变异CV%≤18.48%。特异性CT浓度在10ng/ml时,平均回收率为102.6%;CT浓度在5ng/ml时,平均回收率为111.17%;CT浓度在2.5ng/ml时,平均回收率为123.83%。实验表明该方法可检测霍乱疫苗原液中CT的含量。     

猪细小病毒VP2蛋白主要抗原域间接ELISA方法的建立及初步应用

将已获得的含猪细小病毒VP2蛋白主要抗原域编码基因VP2I重组酵母菌株在优化的条件下进行诱导表达,表达产物蛋白含量达227.6μg/mL,在此基础上以重组蛋白作为包被抗原初步建立了检测猪细小病毒抗体水平的间接ELISA方法,并对该方法进行了优化,结果表明抗原最佳包被浓度5.69μg/mL,而血清最佳稀释倍数为1:80。阳性标准初步定为：OD待测样品＞0.5,且OD待测样品/OD阴性血清＞2.0。采用iVP2I-ELISA对猪血清样品进行检测,结果显示iVP2I-ELISA与HI试验的符合率为97.2%,与国外同类试剂盒的符合率达到91.2%。     

纳米二氧化铈对神经细胞PC12及SH-SY5Y活力的影响

目的:探究纳米二氧化铈(CeO₂)对神经细胞PC12与SH-SY5Y活力的影响。方法:合成纳米CeO₂材料,并对其结构进行表征,性能进行评估。用不同终浓度(1、2.5、5、10、25、50、75、100、150 μg/ml)的纳米CeO₂分别处理PC12细胞与SH-SY5Y细胞24 h,使用MTT法检测其细胞活力。然后使用活性氧清除剂NAC与纳米CeO₂共孵育处理PC12细胞与SH-SY5Y细胞,并用DCFH-DA探针染色,在荧光倒置显微镜下观察各组细胞的数量及其荧光强度。对实验数据采用单因素方差(one-way ANOVA)分析。结果:纳米CeO₂处理后,PC12细胞(P＜0.01)与SH-SY5Y细胞(P＜0.01)的活力都明显下降,与对照组差异明显。DCFH-DA探针染色后,发现纳米CeO₂的浓度越高,荧光强度越强,表明有活性氧(ROS)的产生。活性氧清除剂NAC与纳米CeO₂(100 μg/ml)共同处理PC12后,荧光强度明显减弱。与25 μg/ml (P＜0.01)、50 μg/ml(P＜0.01)、75 μg/ml(P＜0.01)、100 μg/ml(P＜0.01)纳米CeO₂处理组相比,共同处理组细胞活力明显增加。结论:纳米CeO₂对神经细胞PC12与SH-SY5Y的活力有明显的抑制作用,其机制可能与ROS有关。     

重组碱性成纤维细胞生长因子游离巯基的测定分析

建立了一种紫外-可见分光光度检测法,可以快速、简便、稳定地测定重组碱性成纤维细胞生长因子的游离巯基含量。将检测试剂、标准品及待测样品一起反应后,在412 nm波长处读取OD值,以标准品浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标,绘制标准曲线,根据标准曲线计算待测样品中游离巯基含量;同时对该方法进行了方法学验证。结果表明:该方法专属性强,游离巯基含量测定范围为20~80 μg/ml,线性相关系数在0.999以上,回收率范围为91.7%~107.4%;而且该法精密度较好,精密度的变异系数范围为5%~8%。测得的分子表面和总游离巯基含量与理论一致,可用于蛋白质游离巯基检测,以监测分子结构的正确性与均一性。     

裂片石莼水提物清除ABTS和DPPH自由基的光谱学研究

研究了大型海藻裂片石莼和富硒裂片石莼水提物清除 2,2'-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)及 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基能力及其光谱学特征。分光光度计法测定,水提物 ABTS 自由基体系测定波长为 734 nm,体系稳定时间为 6 min;DPPH 自由基体系测定波长为 515 nm,体系稳定时间为 30 min。结果表明,裂片石莼水提物具有良好的抗氧化活性,能有效、快速地抑制溶液中 ABTS 和 DPPH 自由基。在优化选择的反应体系中,裂片石莼、富硒裂片石莼和标准抗氧化剂 VC 对 ABTS 自由基的半数抑制浓度(IC₅₀)分别为 76.40 μg/ml、54.11 μg/ml 和 60.69 μg/ml,说明富硒裂片石莼水提取的总抗氧化活性明显优于 VC,富硒培养可以显著提高裂片石莼的抗氧化活性。裂片石莼、高硒裂片石莼和标准抗氧化剂 VC 对 DPPH 自由基的 IC₅₀ 值分别为 123.29 μg/ml、 76.825 μg/ml 和 24.787 μg/ml。综合上述,富硒培养裂片石莼水提物具有优良的抗氧化活性,对水溶性自由基的抑制率明显高于脂溶性自由基,有广阔的开发前景。     

以SELDI芯片进行细胞标本蛋白分析的方法学研究

目的:探讨以SELDI芯片技术进行细胞标本蛋白分析的最适方法及条件,筛选细胞标本蛋白表达差异。方法:对细胞标本分别用超声裂解法,U9细胞裂解缓冲液配方和自配细胞裂解液提取蛋白,以BCA法测定蛋白浓度;分别以磁珠活化后点样和生物芯片处理器点样使蛋白样品与芯片结合;并对提取蛋白进行检测,比较不同蛋白浓度梯度点样及WCX2,SAX2,IMAC-Cu,H50芯片捕获蛋白差异,用WCX2芯片筛选蛋白差异表达。结果:相同培养条件细胞以上述三种不同蛋白提取方法获得的蛋白浓度分别为:0.25±0.034μg/μl,0.6±0.06μg/μl,1.02±0.077μg/μl;生物芯片处理器点样法操作简单,要求样本量较少,点样时间短;SELDI芯片蛋白质峰图谱与蛋白浓度呈较好的正相关;WCX2,SAX2,H50,IMAC-Cu芯片捕获的蛋白质种类有较大区别;在分子量1000～300000Da范围内,以WCX2芯片共检测到87个差异蛋白峰,其中17个呈趋势变化。结论:上述三种方法比较,选用自配的细胞裂解液提取蛋白的浓度较高且更适于芯片研究;生物芯片处理器能较好地使蛋白与芯片结合;SELDI芯片能准确定位蛋白,且其蛋白质峰与被测蛋白浓度呈正相关变化;SELDI各芯片捕获蛋白类型不同,选择适宜芯片或联合运用芯片检测更易获得较理想蛋白差异表达结果。     

利用悬液芯片系统建立一种高通量检测牛奶中头孢氨苄和莱克多巴胺残留的方法

目的:旨在应用基于荧光编码微球技术的悬液芯片系统建立一种方便、稳定性好及高通量的检测牛奶中头孢氨苄和莱克多巴胺残留的免疫检测方法。方法:利用碳二亚胺法将抗生素合成抗原与表面具有羧基的聚苯乙烯微球通过酰胺键偶联成捕获抗原。利用捕获抗原、抗生素的单克隆抗体及抗生素标准品构建竞争性免疫检测体系。荧光标记的羊抗小鼠的IgG作为荧光探针标记与捕获抗原结合的单克隆抗体得到悬液芯片系统的检测物。悬液芯片系统的检测器由两束特殊的激光构成,能够检测荧光探针荧光强度的同时分辨不同型号的微球以实现高通量检测的目的。结果:通过对头孢氨苄和莱克多巴胺合成抗原包被微球的条件进行优化得到包被100μl的微球所需两者合成抗原的量分别是8.4μg 和 87.73μg;实验结果表明抗生素的单克隆抗体特异性良好;在牛奶中,该方法对头孢氨苄和莱克多巴胺的检测限(LOD)分别是20.59 ng/ml 和23.51 ng/ml, 标准添加回收率在70%~110%之间。     

不同剂量肺炎链球菌荚膜多糖与蛋白结合物的免疫原性比较

用肺炎链球菌19F型、23F型的荚膜多糖(C-PS)分别和破伤风类毒素(TT)蛋白结合,制备了两个型别的多糖-蛋白结合物(19F-TT,23F-TT)。为探讨结合物的最适免疫剂量,以10μg多糖和含1μg、3μg、9μg、27μg多糖的结合物经腹腔免疫NIH小鼠,ELISA方法检测小鼠血清中多糖和含不同多糖的结合物所产生的特异性IgG抗体。结果在不同的剂量免疫小鼠后,3μg剂量组在免疫三针后可诱生高浓度的抗体,但随着免疫剂量的增加,9μg与27μg诱生的抗体浓度较3μg诱生的抗体浓度之间并无显著性差异。含多糖3μg的19F型和23F型多糖蛋白结合物剂量组可诱生高浓度的特异性IgG抗体。     

小单孢菌叠加诱变与发酵过程的研究

采用庆大霉素产生菌—绛红小单孢菌 (M. purpurea) 在培养36h时添加15μg/ml的青霉素,对培养至48h对数生长期的菌体进行紫外线照射+亚硝基胍复合处理,置培养箱中37℃培养5~8d待长出菌落后再用紫外线照射叠加处理,获得一高产菌株N-14。试管发酵生测效价1913u/ml(对照625u/ml);摇瓶发酵培养120h达2178(u/ml),比对照(1243u/ml)提高75.2%;并进行了5L发酵罐发酵培养,发酵过程中测定了发酵液还原糖、总糖、氨基氮、pH、菌体浓度等代谢参数,探索了适合N-14的培养条件,连续5批次生测效价平均1967u/ml,较对照1171u/ml提高了68%, 效果明显。     

6A型肺炎链球菌荚膜多糖水解物的制备及其结合物在小鼠体内免疫原性研究

目的制备6A型肺炎链球菌荚膜多糖(PS6A)水解物及其结合物,研究结合物在小鼠体内的免疫原性。方法在60℃水解温度下,筛选出PS6A水解适宜的醋酸水解浓度和水解时间。通过水解物和原糖(PS6A)的核磁共振氢谱(1H NMR)和磷谱(31P NMR)比较验证水解物结构的正确性。以1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸盐(1-Cyano-4-(dimethylamino)pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化水解物的羟基,并与破伤风类毒素己二酸酰肼衍生物(TTAH)结合,制备结合物PS6A-TTAH;并检测结合物的理化性质。通过抑制ELISA分析原糖、水解物和结合物的抗原性。将小鼠分为2组(PS6A组和PS6A-TTAH组),分别免疫3剂次,用间接ELISA分析原糖和结合物在小鼠体内的免疫原性。结果多糖经0.2 mol/L醋酸60℃水解8 h后,其相对分子质量大小(KD)由0.03升高为0.51,重均相对分子质量(Mw)由8.127×10~5g/mol降为1.175×10~5g/mol。核磁共振结果表明,各特征质子的化学位移相比原糖未发生改变。结合物的游离多糖质量分数为4.55%,游离载体蛋白质质量分数为1.08%。抑制ELISA结果显示,水解物、结合物的抑制曲线与原糖基本吻合。PS6A-TTAH组有剂次加强效应(P分别为0.001、0.004和0.001),其第1~3针免后IgG抗体水平均高于PS6A组,差异均具有统计学意义(P分别为0.001、0.002和0.001)。结论制备的PS6A水解物能有效的保留天然多糖的特异基团,以此水解物制备的结合物在小鼠体内具有良好的免疫应答。     

低密度cDNA芯片技术的优化

为了建立稳定的低密度cDNA芯片技术平台,研究靶基因的最适长度、浓度、点样溶液种类及杂交反应动力学,并了解该芯片的重复性与可靠性.结果表明,杂交具有较好的特异性,不同长度(189～1078bp)、浓度(0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L)的同一靶基因杂交信号强度无明显差别;以50%DMSO为点样溶液者杂交信号最好(P=0.0001).60℃杂交18h信号最佳(P<0.001).重复2次检测结果差异无显著性(P=0.348),重复性较好,其相关系数为0.588.与RT-PCR结果相比,相关系数为-0.778(P<0.0001),特异性为100%,灵敏度为80%(16/20),可靠性较好.     

基于IgG检测为模型的玻璃介质定量蛋白质芯片的研制及评价

为研制高通量定量检测的蛋白质芯片,以人血清IgG为研究模型,选择戊二醛基修饰的玻片为载体,蛋白质样品溶解于20%甘油的PBS,由机械手将浓度为0.5g/L人IgG单克隆抗体点样在玻片上,人血清白蛋白为阴性对照,以1%的BSA为封闭液对蛋白质芯片进行封闭,并经相应处理,构建用于定量检测人血清IgG蛋白质芯片.先以不同浓度IgG标准品为待测样品,建立蛋白质芯片方法和ELISA方法的标准曲线,两条标准曲线的R2值分别为0.996和0.994(P<0.01).两种方法的检测人IgG结果有很好的相关性(R2=0.9937,P<0.01),其敏感性均在15.625μg/L.用两种方法分别检测10例人血清IgG,结果显示两种方法的检测的IgG浓度有很好的一致性,以玻片为载体的蛋白质芯片可用于微量生物样品的定量检测.     

拟南芥中4种细胞分裂素的高效液相色谱法测定

应用高效液相色谱法同时测定拟南芥中4种细胞分裂素组分玉米素(Z)、玉米素核苷(ZR)、6-r,r-二甲基烯丙基氨基嘌呤(2ip)和6-r,r-二甲基烯丙基氨基嘌呤核苷(2ipr)含量。结果表明,采用反相色谱柱Waters C₁₈柱(4.6×250 mm,5 μm),在35℃以乙腈和三乙胺缓冲液为流动相梯度洗脱,流速1 ml/min,在270 nm处能准确检测出拟南芥中4种细胞分裂素组分的含量,检测限达0.001 μg/ml。     

猪细小病毒VP2蛋白主要抗原域间接ELISA方法的建立

将已获得的含猪细小病毒VP2蛋白主要抗原域编码基因VP2I重组酵母菌株在优化的条件下进行诱导表达,表达产物蛋白含量达227.6μg/ml,在此基础上以重组蛋白作为包被抗原初步建立了检测猪细小病毒抗体水平的间接ELISA方法,并对该方法进行了优化,结果表明抗原最佳包被浓度5.69μg/ml,而血清最佳稀释倍数为1∶80.阳性标准初步定为:OD待测样品＞0.5,且OD待测样品/OD阴性血清＞2.0.采用iVP2I-ELISA对猪血清样品进行检测,结果显示iVP2I-ELISA与HI试验的符合率为97.2%,与国外同类试剂盒的符合率达到91.2%.     

7F型肺炎链球菌多糖竞争ELISA检测方法的建立

目的:建立检测7F型肺炎链球菌荚膜多糖的方法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),检测发酵过程中多糖的浓度。方法:包被物为7F型肺炎链球菌多糖,竞争物为待测多糖,建立间接竞争ELISA方法,并验证其准确性和精密度。结果:最佳多糖包被质量浓度为2.5ug/ml,多糖抗体血清稀释度为1:8×104。在检测范围为2.5~30μg/m L时呈线性相关,7F的最低检测限为1.5μg/m L。回归方程为B/B0=-0.4075 Pn7F+0.7632,R2=0.9952.样品加标回收率为95.13%-105%。结论:本研究新建的ELISA方法准确性和精密度较好,能特异性地检测7F型肺炎球菌多糖。     

GnRH-PEⅡ-luffinS重组嵌合毒素的制备与细胞毒性检测

目的：制备以Ⅰ型促性腺激素释放激素（GnRH Ⅰ）为导向部分,以绿脓杆菌外毒素的结构域Ⅱ（PEⅡ）为转膜区,以丝瓜毒素luffinS2为毒性部分的重组嵌合毒素GnRH-PEⅡ-luffinS,体外实验检测其对肿瘤细胞的杀伤作用。方法：重叠PCR法扩增GnRH-PEⅡ-luffinS的基因,克隆至表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆诱导表达,产物用Ni-NTA亲和层析柱纯化。纯化蛋白经重组肠激酶（rEK）切割去除Trx融合蛋白,XTT法检测重组毒素对HeLa、A549、HepG-2、SP2/0和鸡胚成纤维细胞（CEF）的体外细胞毒作用。结果：成功构建了GnRH-PEⅡ-luffinS的表达质粒,并在大肠杆菌中获得表达,纯化后的纯度为94％。GnRH-PEⅡ-luffinS对HeLa、A549、HepG-2和SP2/0的IC50分别为13.50μg/ml、13.74μg/ml、16.79μg/ml和26.07μg/ml,而对CEF无作用。结论：重组嵌合毒素GnRH-PEⅡ-luffinS对肿瘤细胞有较强的杀伤作用。     

伤寒结合疫苗免疫原性和动物安全性研究

伤寒V i多糖与白喉类毒素(DT)蛋白以己二酰肼(ADH)作连接臂,在碳二亚胺(EDAC)的作用下结合成V i-DT结合物,进行抗原性、免疫原性和动物安全性试验。结果显示,3批结合物抗体阳转率均为100%,加强免疫一针后GMT值明显升高(p<0.001),免疫剂量以0.75μg/只抗体增长最为明显,甚至以低剂量0.375μg/只仍能获得较高的抗体滴度,多项动物试验证明该结合物是安全的。显示V i-DT结合物有很好的动物安全性和免疫原性,为临床试验提供实验室依据。     

葛根素对人非小细胞肺癌A549细胞凋亡的作用

目的：观察葛根素对人非小细胞肺癌A549细胞生长的抑制作用及其机制。方法：体外培养人非小细胞肺癌细胞（A549）,不同浓度（60 μg/ml,120 μg/ml,240 μg/ml）葛根素处理24 h后;采用CCK-8法观察葛根素对细胞的增值抑制作用;吖啶橙（AO）/溴化乙锭（EB）双染法及AnnexinⅤ-PI双染流式细胞术检测药物作用前后A549细胞的形态学变化及凋亡状况;Western blot法检测Apelin/APJ蛋白水平的变化。结果：CCK-8法检测结果说明葛根素能抑制A549细胞的增值,具有浓度和时间依赖关系;流式细胞术进一步证实葛根素具有诱导细胞凋亡的作用,与A549细胞组比较,葛根素各处理组Apelin/APJ蛋白水平均有不同程度下调。结论：葛根素可能通过调节Apelin/APJ蛋白的表达诱导A549细胞凋亡。