利用DNA芯片技术高效合成OstreococcusTauri叶绿体基因组

目的：21世纪以来,随着合成生物学的高速发展及其所遇到的问题,开发下一代DNA合成技术已经成为了必然趋势。基因芯片技术和DNA大片段组装技术是建立下一代DNA合成平台的关键技术力量。方法：为了开发具有工业化标准的DNA芯片一基因组合成平台,我们首次利用电化学DNA芯片和DNA大片段组装技术合成了72kb的Ostreococcusmud的全叶绿体基因组。结果：首先,我们使用电化学DNA芯片合成仪合成了564条150bp的OligoMix,并成功扩增分离了其中96％的Oligo序列,剩下的基因组序列是通过传统的固相亚磷酰胺三脂合成法合成。在此基础上,我们利用DNA重组技术将564条150bpOligo片段分三步克隆到了一个pGSYN系统。通过高通量测序,我们证实叶绿体基因组被成功地人工合成。整个合成成本大约是目前传统基因合成成本的10％．20％。结论：研究证实基因芯片技术和DNA大片段组装技术的应用是能够明显的降低现阶段基因组合成工艺的成本。新技术的成熟推广和成本的有效控制也会进一步加速科学家对基因组功能的深入研究以及合成生物学的质的飞跃。     

利用RNA干扰抑制HeLa细胞中CTCF基因的表达

目的:CTCF是一种多功能的转录因子,参与启动子调控、绝缘子功能和遗传印记等过程。利用RNA干扰技术抑制CTCF在体细胞中的表达。方法:以CTCF为靶基因,利用ShortCutRNaseⅢ切割体外转录的长双链RNA制备esiRNA,转染HeLa细胞,用RTReal-TimePCR检测CTCF的mRNA水平,用免疫印迹检测CTCF水平。结果:转染CTCFesiRNA后,细胞内的CTCFmRNA被抑制了70%左右,CTCF水平明显下降。结论:CTCF的esiRNA可以明显抑制CTCF在HeLa细胞中的表达,从而为进一步研究CTCF的未知功能打下了基础。     

猪链球菌2型全基因组DNA芯片的研制及基因表达谱技术平台的建立

目的：研制猪链球菌2型（SS2）全基因组DNA芯片,建立SS2基因表达谱技术平台。方法：利用SS2全基因组序列,挑选出2194条基因,经PCR扩增出2156条基因并将产物纯化,点样制备芯片;将芯片用于表达谱研究,采用实时定量PCR验证表达谱结果,对芯片进行可靠性分析。结果：芯片杂交数据与实时定量PCR验证显示了较高的相关性,二者相关系数r=0.87。结论：研制了一批SS2全基因组DNA芯片,并建立了基于DNA芯片的表达谱技术平台。     

应用DNA芯片技术对禽致病性大肠杆菌可能致病基因体外表达水平的研究

应用DNA芯片研究禽致病性大肠杆菌可能致病基因的表达.构建禽致病性大肠杆菌毒力基因、潜在毒力基因的DNA芯片,应用基因芯片技术对同属O2血清型的禽高致病性大肠杆菌E058株和低致病性大肠杆菌E526株在体外LB培养基和鸡血清培养状态下进行差异表达分析.结果:在体外LB静置培养状态下,低致病株E526与高致病株E058相比共有16个差异基因,均为下调基因.在鸡血清静置培养中,E526与E058相比共有15个差异基因,均为下调基因.应用基因芯片成功筛选了禽致病性大肠杆菌在体外不同条件下的毒力基因及可能毒力基因中差异表达基因,表明一些铁摄取系统相关基因对APEC的毒力较重要,同时也筛选出了一些新的可能致病基因aes-1,aes-2,aes-3,aes-4,aes-6,aes-8,aes-10,aes-13,aes-15,aes-31等.     

HBV－NC1株X基因在真核细胞中表达，基因调控与致癌作用的初探

报道了ＨＢＶ－ＮＣ１株的Ｘ基因进入真核细胞表达载体ｐＸＴ１质粒的ＴＫ启动子之后,转染细胞及表达Ｘ基因成功。即发现包装病毒感染ＮＩＨ／３Ｔ３细胞后有Ｘ基因表达,用斑点杂交又证明此Ｘ基因已整合到细胞的基因组中,当与有ｐＭＳＨ报告基因的质粒共同感染真核细胞后确有激活转录调控现象出现。应用反义的ＸＲＮＡ表达载体感染肝癌细胞发现有接触抑制作用出现。     

NTERA-2细胞中人类CDCA8基因的转录因子谱的芯片分析

为了研究细胞周期相关基因8（CDCA8）的转录调控机制,首先克隆了人类CDCA8基因5’端上游的1071 bp转录调控区。生物信息学预测发现,此区域存在一系列已知转录因子的可能结合位点。联合运用DNA pull-down和转录因子芯片技术分析发现共有114种转录因子在人恶性多发性畸胎瘤细胞（NTERA-2）中与该区域结合, 其中某些转录因子有预测的结合位点,其他没有预测结合位点的转录因子可能是以复合物的形式结合到CDCA8基因的转录调控区。     

Bio-Plex悬浮芯片系统检测两种实验兔白介素基因的差异表达

目的采用液相悬浮芯片系统同时测定实验兔圆小囊中IL-1β、IL-1R1、IL=8、IL-8RA和IL=15各基因的表达情况,并对该方法进行评价。方法利用Affymetrix的Panomics QuantiGene Plex2．0Assay中bDNA信号放大和多磁珠分析技术,来同时检测两种实验兔圆小囊中多重mRNA并定量。建立实验兔免疫相关白介素基因的液相悬浮芯片检测方法。结果可同时检测IL-1β、IL=1R1、IL-8、IL=8RA和IL-15各基因的含量,并发现WHBE兔IL-15基因的相对表达量显著高于JW兔（P〈0．05）,IL-1R1基因的相对表达量显著高于JW兔（P〈0．01）,IL-8RA基因在WHBE兔中的相对表达量也高于JW兔（P〈0．05）。结论建立了实验兔白介素基因的液相悬浮芯片检测方法,WHBE兔的IL-15、IL-1R1和IL-8RA基因表达量较高,可能与WHBE兔独特的免疫学特性有关。     

利用糖芯片技术检测氨基糖苷类抗生素与RNAs和蛋白质之间的相互作用

氨基糖苷类抗生素是一类广谱型抗细菌感染药物,其不断增加的细菌耐药性很大程度上限制了它的临床应用,研究和开发新型氨基糖苷类抗生素具有重要意义。将氨基糖苷类抗生素固定到玻璃片基上,制成糖芯片,再分别与荧光标记的RNAs和蛋白质杂交,通过分析杂交后的荧光信号强度检测它们之间的相互作用。结果显示,氨基糖苷类抗生素芯片可以特异性地与r RNA的A位点模拟物、I型核酶和蛋白酶结合。因此糖芯片技术不仅可以检测氨基糖苷类抗生素与r RNAs的特异性结合,而且可以应用于寻找新型RNA结合配体的研究,为快速鉴定和筛选可紧密结合RNA靶标且毒性较低的新型氨基糖苷类抗生素奠定了一定的基础。     

人线粒体tRNALeu(UUR)基因氧化损伤与修复研究

人mtDNA比核DNA更易受到自由基的氧化损伤,这些损伤可以被线粒体内的DNA修复机制所修复,损伤与修复是决定突变是否产生的两个重要因素.为了确定氧化损伤与损伤后修复对mtDNA突变的具体影响,采用四氧嘧啶处理LO2细胞,这种试剂进入细胞后,经氧化还原反应生成的自由基与线粒体自身代谢产生的自由基类似,然后观察自由基对细胞mtDNA的氧化损伤与损伤后DNA修复的动力学变化.由于线粒体的正常功能为修复机制所必需,采用MTT细胞活力实验检测不同浓度四氧嘧啶处理下线粒体酶活力,发现9 mmol/L四氧嘧啶培养细胞1h后,线粒体琥珀酸脱氢酶功能在撤去药物后0,2,8和24 h时间点均无明显变化.提取各组细胞的mtDNA,用EndoⅢ和Fgp两种酶切除受氧化损伤的核苷酸,然后用碱性琼脂糖凝胶电泳分离大小不等的mtDNA,进行DNA印迹实验,地高辛-抗体-碱性磷酸酶系统显色,检测完整与断裂的mtDNA量,利用Poisson公式(s=-lnP0/P,P0为未断裂链光密度值,P为所有链光密度值总和)计算一个mtDNA分子的平均损伤频率,结果显示,9 mmol/L四氧嘧啶处理细胞1 h,链平均损伤频率由对照的0.11个/分子增加至5.60个/分子,明显增加了mtDNA上核苷酸的氧化损伤,除去药物后8 h,绝大部分损伤可被修复,损伤频率减至0.40个/分子,除去药物后24h核苷酸的氧化损伤恢复至正常水平.采用接头介导PCR(LM-PCR)检测MTTL1基因区域内单个核苷酸的损伤与修复动力学.这种方法可以检测各组mtDNA上MTTL1基因75 bp区域内单个核苷酸损伤的部位及频率.结果显示,人MTTL1基因存在20个易受氧化损伤的核苷酸热点,经与相应区域内文献报道的16个突变热点比较,有12个热点部位重合,而修复未显示热点部位或区域.结果提示,自由基对核苷酸的选择性氧化损伤是决定mtDNA点突变发生及发生部位的主要原因.     

维甲酸受体β基因RNAi表达质粒的构建及其对A549细胞增殖和分化的影响

目的：利用RNA干扰（RNAi）技术,构建针对维甲酸受体（RAR）β基因的小干扰RNA（siRNA）表达质粒,诱导RARβ基因沉默,并观察其对肺癌细胞A549株的细胞周期和增殖的影响。方法：依据设计siRNA的原则。针对人RARβ的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆到pSUPER-NEO-GFP真核表达载体中构建重组体pSUPER-RAR[β转染至A549细胞中,以空质粒和RARβ高表达质粒转染为对照,用Western印迹检测RARβ基因的表达,并采用M1Tr试验检测转染后细胞株的增殖和细胞分化情况。结果：表达人类RARβ基因的siRNA重组表达质粒构建成功;MTT试验结果表明,转染的A549-RARβ-si细胞增殖能力降低。结论：采用RNAi技术特异阻断RARB基因表达,通过转染A549细胞,可使其细胞形态发生变化,并抑制其细胞生长。     

基因芯片表达谱数据的预处理分析

基因芯片数据的预处理是一个十分关键的步骤,通过数据过滤获取需要的数据、数据转换满足正态分布的分析要求、缺失值的估计弥补不完整的数据、数据归一化纠正系统误差等处理为后续分析工作做准备,预处理分析的重要性并不亚于基因芯片的后续分析,它将直接影响后续分析是否能得到预期的结果.本文重点综述了cDNA芯片的数据预处理,简要地概述寡核苷酸芯片的数据预处理.     

cDNA微阵列技术分析NAG7基因对鼻咽癌细胞基因表达谱的影响

运用cDNA微阵列技术分析NAG7基因重表达对HNE1细胞基因表达谱的影响.抽提HNE1细胞和pcDNA3.1(+)/NAG7/HNE1细胞总RNA,分离polyA mRNA,将mRNA逆转录为cDNA,并在逆转录过程中用³³P-dATP进行标记,与含有16 150个基因和表达序列标签(EST)的cDNA表达阵列膜杂交,获得基因表达图谱.Array Gauge软件分析NAG7基因的重表达所导致的鼻咽癌细胞HNE1基因表达谱改变,并用RNA印迹对微阵列杂交结果进行验证.结果分析表明,2倍以上的差异表达基因或EST 179个,其中表达上调的91个,表达下调的88个;已明确基因表达产物的上调基因29个,下调基因37个.在差异表达基因中,涉及基因转录调控、信号转导、细胞生长、细胞代谢和细胞凋亡等基因.RNA印迹证实生长阻滞特异蛋白1（gas 1）基因表达上调.特别值得关注的是, 先前的蛋白质组研究结果亦发现NAG7基因可导致生长阻滞特异蛋白1表达上调,说明gas 1基因在NAG7重表达的HNE1细胞中具有重要作用,这为深入研究NAG7基因的作用环节和机理提供了重要的线索.     

基因表达谱微阵列网络数据库在肿瘤研究中的应用

基因表达谱微阵列数据库是一类可提供存储、查询、下载分析的在线网络数据库,在肿瘤相关领域的研究中提供了大量的数据来源。由于微阵列分析对于无生物/医学信息学专业背景的研究人员仍然有较多困难,致使该数据库的使用尚未普及。本文从数据查询、下载分析和使用方法等方面对常用基因表达谱微阵列数据库进行概述,并对现阶段基因表达微阵列数据库的应用策略进行总结,旨在帮助该领域研究的初学工作者了解数据库的基本知识并推动其在科研工作中的应用。     

用限制性cDNA文库制作K562细胞基因表达谱芯片探针

以人红白血病K562细胞为材料,应用限制性显示PCR（RD-PCR）技术构建cDNA文库,该文库通过PCR引物3′端延伸两个不同碱基形成136对引物对cDNA进行限制性扩增,得到136组不同的PCR扩增产物,纯化后与载体连接并转化细菌,即为限制性cDNA文库,根据不同的分组进行克隆的鉴定和分离。并进行大量扩增制备cDNA芯片探针,该方法构建的文库因经过了限制性分组扩增,每组均含有特定的cDNA,因而大大加快了随后克隆的分离 和鉴定的速度,为基因芯片探针制备提供了一个新方法。     

用基因表达谱芯片研究人正常肝和肝细胞癌中差异表达的基因

以基因表达谱芯片对人正常肝及肝癌组织基因表达的差异性进行了研究比较。奖４０９６条人ｃＤＮＡ用点样仪点在特制玻片上制备成表达谱芯片;利用肝和肝癌组织的ｍＲＮＡ通过逆转录方法,将Ｃｙ３和Ｃｙ５２种荧光分别标记到两种组织的ｃＤＮＡ上,制备成ｃＤＮＡ探针,并与表达谱芯片进行杂交及扫描,重复４次实验,通过计算机数据处理判定基因是否在上述２种组织中有表达差异,筛选出差异表达的基因共９０３条。基因芯片技术可同时     

cDNA Microarray Analysis of Changes in Gene Expression Associated with MPP+ Toxicity in SH-SY5Y Cells

cDNA microarray analysis of 1-methyl-4-phenyl-pyridinium (MPP⁺) toxicity (1 mM, 72 h) in undifferentiated SH-SY5Y cells identified 48 genes that displayed a signal intensity greater than the mean of all differentially expressed genes and a two-fold or greater difference in normalized expression. RT-PCR analysis of a subset of genes showed that c-Myc and RNA-binding protein 3 (RMB3) expression decreased by 50% after 72 h of exposure to MPP⁺ (1 mM) but did not change after 72 h of exposure to 6-hydroxydopamine (25 M), rotenone (50 nM), and hydrogen peroxide (600 M). Exposure of retinoic acid (RA)-differentiated SH-SY5Y cells to MPP⁺ (1 mM, 72 h) also resulted in a decrease in RMB3 expression and an increase in GADD153 expression. In contrast, c-Myc expression was slightly increased in RA-differentiated cells. Collectively, these data provide new insights into the molecular mechanisms of MPP⁺ toxicity and show that MPP⁺ can elicit distinct patterns of gene expression in undifferentiated and RA-differentiated SH-SY5Y cells.     

cDNA芯片研发及其在肥胖患者脂肪基因差异表达研究中的应用

为了加快基因功能的研究,利用已有的来源于不同组织的cDNA克隆,并通过交换和购买补充了低丰度和染色体覆盖不完全的部分cDNA,研制开发出具有相当代表性、覆盖较完全的高密度cDNA表达型基因芯片,每张芯片上含有384个质控DNA和12 630个cDNA探针,其中包括12 508个Unigene和122个表达序列标签(EST).利用这些芯片,对肥胖患者及正常人内脏脂肪组织基因表达谱进行了初步研究,并发现在肥胖患者内脏脂肪组织差异表达的基因,其中上调的有与凋亡相关的基因、与免疫有关的基因以及与能量代谢有关的基因等,而下调的主要是与脂肪酸及胆固醇合成有关的基因,对这些基因进一步的功能研究将为阐明肥胖发生机制奠定基础.