放射诱导型增强子E6可提高hTERTp的放射敏感性

目的：构建融合启动子E6.hTERTp,以探讨放射干预后放射敏感启动子片段E6对人端粒酶逆转录酶启动子（hTERTp）启动活性以及对鼻咽癌靶向调控的影响。方法：通过Overlap PCR法合成融合启动子E6.hTERTp,连接至PGL3 basic质粒。构建含EGR-1启动子（EGR-1p）以及hTERTp的PGL3 basic载体做对照。使用Lipo2000将报告载体以及pRL-SV40质粒共转染正常人成纤维细胞HDF以及人鼻咽癌CNE-2细胞,并给予不同剂量放射干预,双荧光素酶法检测其启动活性。t检验分析不同细胞系中不同放射条件下各启动子启动活性差别。结果：在正常HDF细胞系内,无论放射与否,hTERTp组以及E6.hTERTp组的启动活性均很低;而在CNE2细胞系中,三种启动子启动活性均随放射剂量增加而增加,其增长幅度从大到小分别是EGR-1p组、E6.hTERTp组、hTERTp组。在相同放射剂量干预下,EGR-1P组、E6.hTERTp组与hTERTp组三组间的启动活性两两之间均有统计学差别（p〈0.01）。结论：放射诱导型增强子E6能够明显提高hTERTp放射敏感性,且不影响其在鼻咽癌中靶向性调控作用,为该类肿瘤的放射-基因治疗提供了新的思路。     

原发性肝癌ATM基因启动子甲基化及其与放疗疗效的相关性

为探究原发性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)共济失调-毛细血管扩张突变基因(ataxia-telangiectasia mutated gene, ATM)启动子甲基化情况,分析其与临床特征的关系及与放疗疗效的相关性,采用甲基化特异性PCR法(methylation-specific PCR, MSP)检测50对肝癌手术标本及相应的癌旁肝组织标本、20例正常肝组织、38例局部中晚期肝癌肝穿刺标本的ATM基因启动子甲基化状态,并采用BSP (bisulfite sequencing PCR)测序法对样本的甲基化状态进行验证,分析ATM基因启动子甲基化状态与患者临床特征的关系及与放疗疗效的相关性。结果发现, 88例肝癌组织中ATM基因启动子甲基化率为39.8%(35/88),其中38例肝癌肝穿刺标本有42.1%(16/38)存在ATM基因启动子甲基化, 50例肝癌手术标本有38%(19/50)存在ATM基因启动子甲基化,相应癌旁肝组织只有8.0%(4/50)存在ATM基因启动子甲基化;正常肝组织未发现有ATM基因启动子甲基化, ATM基因启动子甲基化在肝癌组织中的发生率与癌旁肝组织、正常肝组织相比差异具有统计学意义(χ2=24.818,P0.05)。此外,存在ATM基因启动子甲基化的局部中晚期肝癌患者的放疗疗效显著优于无甲基化的病例(χ2=5.955,P=0.015), ATM基因启动子甲基化状态与肝癌放疗疗效呈显著正相关关系(r=0.396, P=0.014)。实验结果表明原发性肝癌ATM基因启动子存在异常甲基化, ATM基因启动子甲基化状态与肝癌放疗疗效关系密切,可为筛选放射敏感差异病人提供新的思路。     

放射诱导调控腺病毒介导gfp报告基因在肿瘤细胞内的表达

为建立放射诱导基因表达调控系统并用于肿瘤的基因治疗,利用PCR技术克隆出放射诱导基因Egr-1基因启动子,经测序证实后与报告基因gfp连接,并利用新型、高效的细菌内同源重组腺病毒载体制备方法制备出重组腺病毒AdEgr-GFP。感染腺病毒的肿瘤细胞给予不同剂量的γ射线照射,体外采用FACS方法检测GFP的表达发现,照射可明显提高GFP表达,并呈剂量依赖性,Western印迹检测也显示类似的结果,为进行体内实验,瘤内注射AdEgr-GFP腺病毒后48h,肿瘤局部接受不同剂量的γ射线照射,8h后制备肿瘤组织标本用于分析GFP的表达。肿组织图像分析结果显示,γ射线照射可显著提高肿瘤组织中GFP的表达,并呈剂量依赖性,结果说明,放射经Egr-1启动子可有效调控腺病毒介导gfp基因的肿瘤细胞内表达。     

碱性Krueppel样因子对和珠蛋白基因的转录调控作用

为探索碱性Kruppel样因子（basic Krueppel-like factor,BKLF)对γ-和ε珠蛋白基因的转录调控作用,构建了人类BKLF(hBKLF)基因全长及N端缺失40个氨基酸的真核表达载体,并将其瞬时转染到COS7细胞中做报告实验。结果表明,hBKLF能够抑制γ-和ε-珠蛋白基因启动子的活性,而hBKLF特异的反义核酸则激活这两种基因的启动子。N端缺失40个氨基酸不影响这种转录抑制功能。hBKLF强烈抑制FKLF(embryonic/fetalβ-like globin gene-activating Krueppel-like factor)引起的对γ-和ε-珠蛋白基因的转录激活作用。另外BKLF基因能够与SHP1（SH2-containing protein tyrosine phosphatase1)基因启动子区的CACCC元件结合。这些结果提示γ-和ε-珠蛋白基因可能是BKLF的转录调控对象,为研究BKLF参与血细胞特异表达基因的调控提供了依据。     

自噬与肿瘤耐受的关系

肿瘤是机体在各种致癌因素作用下,局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控,导致其克隆性异常增生而形成的新生物。目前化疗和放疗是其治疗的重要手段,但一直以来,耐受性的产生成为肿瘤治疗的主要障碍。自噬是一种进化保守的溶酶体依赖的自身降解途径,越来越多的证据表明肿瘤的耐受性与自噬有关:放疗和化疗可以诱导保护性自噬的产生,帮助肿瘤细胞逃避凋亡途径。其机制可能与PI3KAkt-mTOR通路、Beclin 1、ATP、p53等有关,深入了解自噬与肿瘤耐受性之间的调控不仅为克服肿瘤细胞耐受性提供了靶点,也为自噬与凋亡关系的研究提供了线索。     

FLT-1启动子荧光素酶报告基因重组体的构建和鉴定

目的：为探索FLT-1启动子靶向调控活性分析,克隆FLT-1启动子基因序列,构建并鉴定肿-1启动子调控的荧光素酶报告基因重组体pGL3-FLT—Basic—luc。方法：应用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增FLT-1启动子序列,定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic—luc中,构建含有正确目的基因的报告基因重组体pGL3-FIT—Basic—luc,通过限性内切酶酶切、PCR及测序进行鉴定。结果：通过酶切鉴定及基因测定证明,所克隆的基因产物与预期结果-致,序列无碱基突变。结论：成功构建了含有FLT-1启动子基因序列的荧光素酶报告基因真核表达载体,为下-步分析该启动子活性及血管疾病的基因治疗奠定基础。     

即刻早期基因Egr—1与肿瘤研究

早期生长反应基因Erg-1属即刻早期基因家族,其编码的蛋白产物是一种含锌指结构的转录因子,能与多种下游基因的启动子区域相结合,上调或下调基因的转录,产生各种生物学功能。Egr-1不仅与细胞生长有关,而且参与多种细胞的正常分化。近年来国外的一些研究表明Egr-1不仅与细胞生长有关,而且参与多种细胞的正常分化。近年来国外的一些研究表明,Erg-1在多种肿瘤细胞中表达消失,外源性Egr-1的导入有抑制肿瘤细胞生长的作用。     

猪ANK1基因单核苷酸多态性与启动子区域活性分析

本实验旨在通过构建猪ANK1基因启动子序列的双荧光素酶报告基因系统,分析ANK1基因启动子活性,寻找ANK1基因启动子的核心区域,为下一步研究猪ANK1基因启动子序列SNP与活性之间的关系提供依据。利用Methprimer和Ali Baba2.1软件预测分析ANK1基因启动子区序列,预测其转录结合位点和Cp G岛。利用直接测序法,对广西巴马小型猪和长白猪共64个样品的ANK1基因启动子核心区域的单核苷酸多态性进行研究。双荧光素酶实验结果表明所预测的序列具有启动子活性,并寻找到启动子的核心区域;同时发现了16个SNP位点,它们分别是:-19、-133、-147、-187、-228、-246、-332、-360、-369、-468、-549、-550、-615、-696、-725和-798。     

DNA结合抑制因子4研究进展

DNA结合抑制因子4（Id4）属于螺旋-环-螺旋（HLH）蛋白家族,可与碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）蛋白分子形成二聚体,负性调节bHLH的功能,影响相关基因的转录。Id4在正常组织与肿瘤中有不同的表达谱,与肿瘤进程有密切关系。在肿瘤发生、发展过程中,Id4通过竞争结合转录因子等途径而发挥重要作用。Id4基因是抗癌治疗的靶因子,其启动子区在多种肿瘤中发生甲基化导致基因沉默,可以用于临床诊断和治疗,有广阔的应用前景。     

人ACT1基因P7启动子的克隆及序列分析

克隆并测定人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)基因P7启动子的序列,进一步探讨ACAT1基因表达的转录调控特点并分析其特异性转录位点。根据GenBank数据库提供的人A- CAT1基因P7启动子核苷酸序列,应用PCR方法从人单核细胞系THP-1扩增分离出ACAT1基因P7启动子全长片段,将PCR产物克隆入T载体,并对所获得的序列进行生物学信息分析。经琼脂糖凝胶电泳及直接测序鉴定,克隆的ACAT1基因P7启动子片段碱基序列与Gen Bank数据库一致。成功克隆了ACAT1基因P7启动子,为研究在动脉粥样硬化过程中AcAT1基因的转录调控机制奠定基础。     

Tumor-specific gene expression in hepatic metastases by a replication-activated adenovirus vector

Clinical applications of tumor gene therapy require tumor-specific delivery or expression of therapeutic genes in order to maximize the oncolytic index and minimize side effects. This study demonstrates activation of transgene expression exclusively in hepatic metastases after systemic application of a modified first-generation (E1A/E1B-deleted) adenovirus vector (AdE1-) in mouse tumor models. The discrimination between tumors and normal liver tissue is based on selective DNA replication of AdE1- vectors in tumor cells. This new AdE1- based vector system uses homologous recombination between inverted repeats to mediate precise rearrangements within the viral genome. As a result of these rearrangements, a promoter is brought into conjunction with a reporter gene creating a functional expression cassette. Genomic rearrangements are dependent upon viral DNA replication, which in turn occurs specifically in tumor cells. In a mouse tumor model with liver metastases derived from human tumor cells, a single systemic administration of replication activated AdE1- vectors achieved transgene expression in every metastasis, whereas no extra-tumoral transgene induction was observed. Here we provide a new concept for tumor-specific gene expression that is also applicable for other conditionally replicating adenovirus vectors.