HPLC监测微囊化细胞培养中乳酸和丙酮酸的变化

ＨＰＬＣ监测微囊化细胞培养中乳酸和丙酮酸的变化朱冬发,李士云,吉鑫松,袁中一（中国科学院上海生物化学研究所,２０００３１）关键词丙酮酸;乳酸;ＨＰＬＣ;细胞培养;微囊化动物细胞随着基因工程和细胞培养技术的发展,人们越来越重视利用生物反应器大规模培养基...     

动物细胞培养过程中的细胞凋亡

细胞培养过程中的细胞凋 细胞受环境因素的影响而发生的现象。随着对细胞凋亡的分子生物学和细胞生物学了解的深入,显示了有效地控制动物细胞增减保细胞凋亡的巨大潜力。     

动物细胞培养过程中的细胞凋亡

细胞培养过程中的细胞凋亡是细胞受环境因素的影响而发生的现象。随着对细胞凋亡的分子生物学和细胞生物学了解的深入,显示了有效地控制动物细胞培养中细胞凋亡的巨大潜力。包括采用ＤＮＡ重组技术把抗细胞凋亡的基因导入细胞和在培基中加入具有抗细胞凋亡的生存因子或化合物等手段已用于控制细胞培养过程中的细胞凋亡。这些技术将大大延长细胞达到饱和密度后的培养时间,提高细胞培养系统的生产效率。     

动物细胞培养过程中的细胞自然凋亡

细胞培养过程中的细胞自然凋亡是细胞受环境压力的影响而发生的现象。随着细胞自然凋亡的分子生物学和生物化学研究的深入,对以动物细胞产品生产为目的的细胞培养产业将产生极有价值的影响。采用DNA重组技术把预防细胞自然凋亡的基因导入细胞和在培基中加入具有抗细胞自然凋亡的化合物等手段已用于预防或减缓细胞培养过程中的细胞自然凋亡。这些技术将大大延长细胞达到饱和密度后的培养时间,从而使细胞培养系统的生产效率得以显著提高。     

细胞微囊化免疫隔离技术在移植医学中的应用

作为一种十分有效的免疫隔离技术,细胞微囊化可排除细胞移植中出现的宿主与移植物之间的双向排斥作用,从而使能分泌生物活性物质的细胞在移植后得以存活。目前报道的多种微囊材料中,以海藻酸钠一聚赖氨酸一海藻酸钠的应用最为广泛,可通过提高其生物相容性来减弱免疫排斥反应。细胞微囊化在医学治疗上正在发挥越来越大的作用,特别是基因修饰细胞日益成为研究的焦点。尽管该技术尚需改进,但它在异体和异种组织或细胞移植等方面有着广阔的应用前景。     

蛋白水解物在动物细胞培养中的应用研究进展

蛋白水解物是蛋白质经水解得到的混合物,其主要成分为肽类。蛋白水解物可优化动物细胞培养基的组成,并且其中所含部分肽段可作为外部分子信号对细胞代谢、生物合成、生长、凋亡及产物表达等生命活动产生特殊的调控作用,因而被广泛应用于动物细胞培养领域,以生产单克隆抗体、疫苗、干扰素等生物制品。其作为无血清或低血清培养基的营养成分,可消除或降低血清带来的病毒微生物污染。随着蛋白水解物生产工艺的改进及优质产品的问世,其必将在细胞培养等生物技术领域发挥越来越重要的作用。     

微囊化干细胞及其应用研究进展

干细胞极强的自我更新能力和多向分化潜能使其可以成为绝佳的种子细胞来源,用于各种疑难疾病的治疗。微胶囊不仅可以为细胞提供三维生长微环境,而且具有良好的免疫隔离性能和生物相容性。微囊化干细胞技术为干细胞大规模、高活性体外培养及长期保存提供了新的技术支持,为细胞移植疗法开辟了新途径。以下首先简述了微囊化技术的发展情况,然后介绍了目前用于微囊化干细胞的材料、制备方法及其免疫隔离作用,重点阐述了近年来微囊化各种不同类型干细胞的研究和应用进展。最后,提出目前微胶囊化干细胞的问题所在并对此技术进行展望。     

大孔微载体在动物细胞培养中的应用

很久以前人们就培养动物细胞以生产疫苗及人用蛋白,尤其是当人们发现原核细胞表达真核生物的蛋白质时常常不能进行正确的蛋白修饰,使其不具有生物活性,而真核生物基因在动物细胞内表达时则能准确地进行蛋白质的糖基化、磷酸化等修饰。现在,动物细胞培养已广泛用于生产各种疫苗、单抗和某些高值生物产品（如EPO、tPA等）[1]。根据动物细胞的生长诗性,可将其分为两类：一类是非贴壁依赖型细胞,可以悬浮生长;另一类是贴壁依赖细胞,必需固定体表面才能生长[2]．最初,人们利用滚瓶内表面培养这种细胞。但是,这种操作劳动强度大,生产…     

VerO细胞在气升式反应器中的微载体培养

哺乳动物细胞的大规模培养是生产许多医学上重要生物制品的一种主要方法之－⑴。很多有工业价值的动物细胞都是贴壁细胞,必须附着在一定的表面上才能生长,微载体培养是一种有效的体系⑵。用于微载体培养的反应器多为搅拌式反应器,近年来,流化床式反应器越来越引起生化工程学家的重视。有希望用于大规模动物细胞培养的主要是液升和气升式。液升式反应器的优点是培养液可以间接氧饱和,气泡和细胞不直接接触。在气升式流态反应器中,气泡与细胞直接接触,其优点是操作方便,设备筒单。本文报道通过气升流态化反应器实现高密度贴壁细胞培养工艺条件的研究。     

乳杆菌微胶囊化培养的研究

采用MaCSPDMDAAC微胶囊对两种乳杆菌进行了固定化发酵研究。结果表明,两种乳杆菌能够在微胶囊内很好地生长和繁殖,菌浓度可分别达到18×1011/mL 胶囊和269×1011/mL胶囊,比游离培养高出十倍以上,并且能与游离发酵一样产生乳酸,糖耗时间可缩短1/3～2/3。进行的多批次发酵显示了巨大的产酸能力。     

动物细胞培养用多孔载体的研制

多孔载体是一种新型的用于动物细胞培养的优秀的细胞支持物,其内部网状结构的小孔具有固定细胞和保护细胞免受机械损伤的功能,适合于贴壁细胞和悬浮细胞的培养,能提高培养密度,可应用于大规模培养系统。本文综述了多孔载体的物化性质、制作材料和制备方法。     

纤维素多孔微载体的制备及其用于动物细胞培养

将纤维素铜氨溶液喷洒至-40℃的硅油：正己烷=1：4的冷冻液中形成含冰晶的微球,用-30℃、40%的H₂SO₄再生纤维素,并用EDAE盐酸盐修饰其表面,制成适合动物细胞培养的纤维素多孔微载体。利用该微载体培养能分泌尿激酶原(Pro-UK)的重组CHO细胞,在100mL搅拌瓶中换液培养25d,细胞最高密度为6.3×10⁶/mL,尿激酶原最高活性为2325IU/mL,共获28.7mg产品。之后转入1000mL搅拌瓶中培养,可观察到细胞可从种子微载体中自动转移到新微载体中生长繁殖直至所有微载体中都长有细胞。在25d二级培养中,细胞最高密度为7.3×10⁶/mL,尿激酶原最高活性为3108IU/mL,共获含353mg尿激酶原的上清13.7L。在培养后期换用无血清培养基培养,细胞生长及蛋白表达水平正常。     

动物细胞大规模培养过程中细胞凋亡的检测与控制

动物细胞大规模培养技术是目前生物技术制药产业广泛采用的技术平台,凋亡是大规模培养过程中细胞的主要死亡方式。近些年来,细胞凋亡的形态学特征和分子机制已得到初步阐明,并由此开发出了一系列的细胞凋亡检测和控制方法,为提高大规模培养中的细胞活力发挥了重要作用。     

微囊化K562细胞生长周期及代谢特性的研究

以K562细胞为模型,分别进行微囊化和游离培养,运用流式细胞术考察两种培养体系下细胞周期和生长代谢变化;建立数学模型,模拟了两种培养体系下细胞的生长活性和代谢特性。实验发现：微囊化培养过程中的K562细胞处于DNA合成期（S期）的百分含量显著高于游离培养,并且细胞保持较高的增殖活性。模型计算表明,所建模型动力学参数能够很好地描述微囊化和游离两种培养体系下细胞的代谢情况;对细胞活性的理论计算表明,微囊化的细胞具有较高的增殖和代谢活性,同时细胞能够较长时间保持此活性;模型参数表明,两种培养体系下,葡萄糖对细胞生长的影响无显著差别 (k^Free_L≈k^APA_L),乳酸对游离培养细胞的生长具有明显抑制作用,但对微囊化培养细胞抑制作用较小(kFreeL>≈kAPAL)。     

Continuous Monitoring of Extracellular Glucose Concentrations in the Striatum of Freely Moving Rats with an Implanted Glucose Biosensor

Abstract: We have used a glucose oxidase-based sensor implanted in the striatum of freely moving rats to determine the concentration of extracellular glucose in two distinct ways. With a modification of the zero net flux method, in which different concentrations of glucose are infused through a dialysis probe glued to the biosensor, we calculated the concentration at which there was no change in glucose current by regression analysis; this gave a concentration of 0.351 ± 0.016 m M . Calculating the concentration from the basal current and the in vitro calibration of the biosensor was not significantly different from this. The basal extracellular glucose concentration determined by either method remained constant over a period of several days. Infusion of 50 µ M veratridine through the adjacent dialysis probe caused a steep decrease in glucose current as soon as the drug reached the brain in contrast to the delayed fall (7.5 min) seen with microdialysis in previous experiments from this laboratory. These results demonstrate that this biosensor provides a direct, real-time measure of the extracellular concentration of glucose.     

大规模动物细胞培养技术研究进展

利用动物细胞大规模培养技术可生产多种生物制品,为提高细胞活力和表达水平及有利于表达产物的纯化,采用有多种添加成分的无血清培养基培养细胞,选择更有利于细胞生长又可提高培养细胞密度的微载体和条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器,在线监控细胞生存环境和生理活动,减少培养过程培养基中的抑制因素,可创造更适合细胞生存的环境,提高表达水平,向细胞中导入抗凋亡基因,可提高细胞活性和蛋白产量。利用多也微载体以球转球方式大规模培养动物细胞有很好的发展前景。     

Application of screen-printed microband biosensors to end-point measurements of glucose and cell numbers in HepG2 cell culture

Microband glucose biosensors were produced by insulating and sectioning through a screen-printed, water-based carbon electrode containing cobalt phthalocyanine redox mediator and glucose oxidase enzyme. Under quiescent conditions at 37 °C, at an operating potential of +0.4 V, they produced an amperometric response to glucose in buffer solutions with a sensitivity of 26.4 nA/mM and a linear range of 0.45 to 9.0 mM. An optimal pH value of 8.5 was obtained under these conditions, and a value for activation energy of 40.55 kJ mol⁻¹ was calculated. In culture medium (pH 7.3), a sensitivity of 13 nA/mM was obtained and the response was linear up to 5 mM with a detection limit of 0.5 mM. The working concentration was up to 20 mM glucose with a precision of 11.3% for replicate biosensors (n = 4). The microband biosensors were applied to determine end-point glucose concentrations in culture medium by monitoring steady-state current responses 400 s after transfer of the biosensors into different sample solutions. In conjunction with cultures of HepG2 (human Caucasian hepatocyte carcinoma) cells, current responses obtained in 24-h supernatants showed an inverse correlation (R² = 0.98) with cell number, indicating that the biosensors were applicable for monitoring glucose metabolism by cells and of quantifying cell number. Glucose concentrations determined using the biosensor assay were in good agreement, for concentrations up to 20 mM, with those determined spectrophotometrically (R² = 0.99). This method of end-point glucose determination was used to provide an estimated rate of glucose uptake for HepG2 cells of 7.9 nmol/(10⁶ cells min) based on a 24-h period in culture.     

Intracellular CHO Cell Metabolite Profiling Reveals Steady‐State Dependent Metabolic Fingerprints in Perfusion Culture

Perfusion cell culture processes allow the steady‐state culture of mammalian cells at high viable cell density, which is beneficial for overall product yields and homogeneity of product quality in the manufacturing of therapeutic proteins. In this study, the extent of metabolic steady state and the change of the metabolite profile between different steady states of an industrial Chinese hamster ovary (CHO) cell line producing a monoclonal antibody (mAb) was investigated in stirred tank perfusion bioreactors. Matrix‐assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI‐TOF‐MS) of daily cell extracts revealed more than a hundred peaks, among which 76 metabolites were identified by tandem MS (MS/MS) and high resolution Fourier transform ion cyclotron resonance (FT‐ICR) MS. Nucleotide ratios (Uridine (U)‐ratio, nucleotide triphosphate (NTP)‐ratio and energy charge (EC)) and multivariate analysis of all features indicated a consistent metabolite profile for a stable culture performed at 40 × 10⁶ cells/mL over 26 days of culture. Conversely, the reactor was operated continuously so as to reach three distinct steady states one after the other at 20, 60, and 40 × 10⁶ cells/mL. In each case, a stable metabolite profile was achieved after an initial transient phase of approximately three days at constant cell density when varying between these set points. Clear clustering according to cell density was observed by principal component analysis, indicating steady‐state dependent metabolite profiles. In particular, varying levels of nucleotides, nucleotide sugar, and lipid precursors explained most of the variance between the different cell density set points. © 2016 American Institute of Chemical Engineers Biotechnol. Prog., 33:879–890, 2017     

动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择

目前全世界蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求已远远超过了现有生产能力。动物细胞规模化生产重组蛋白和抗体的工艺选择可考虑使用当前较成熟的工业化支持技术平台,以缩短产品工艺研发的时间,加快工业化进程。当前被FDA批准的生物技术产品以及公开发表的生产工艺占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养,工艺设计是流加或灌流培养。其大规模细胞培养生产所面临的挑战是获得最大生产力的同时注重维持产品的质量;去除所有培养环境中外源因子的污染,更为精确有效的工艺控制手段,规模化培养中氧气的限定与溶解CO2浓度累积的控制等。