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1.
应用电激法和聚乙二醇法以及脂质体协调的上述两种方法对烟草和青菜原生质体进行烟草花叶病毒TMV-RNA的导入试验,并应用酶标免疫技术、电镜观察、半叶接种和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)等方法对在原生质体中增殖的TMV进行鉴定。实验证明,虽然电激法和聚乙二醇法均能有效地将外源病毒基因导入植物原生质体,但经阳离子脂质体处理后的TMV-RNA,其转染效率可提高10倍以上。TMV在原生质体转染48小时后达到复制高峰。SDS-PAGE显示,原生质体转染48小时后,除出现TMV外壳蛋白明显条带外,尚有1条分子量在50~55kd蛋白质条带也明显增强。这些研究结果对植物遗传工程和抗病毒基因有种研究提供重要的数据和基础。 相似文献
2.
克隆了能在植物中表达白喉毒素A链基因(DTA)负链RNA的基因TCDTAN,这个基因的读码框5′端上游带有TMV外壳蛋白基因5′端上游631个碱基,它的DNA和TMV-RNA共转化烟草原生质体后,能抑制同时导入原生持体的堪因的表达,CAT基因表达的抑制,是TCDTAN基因产生白喉毒素A链蛋白的结果,TCDTNA基因上TMV外壳蛋白基因5′端上游片段,是产生白喉毒素A链mRNA的必要条件,只有用多量 相似文献
3.
用原生质体瞬间表达的方法证明,在烟草细胞中TMV外壳蛋白亚基因组RNA的生成,不是通过核酸酶在基因组RNA上直接切割,也不是通过在生成负链RNA时预成性终止,再从这种负链RNA终止部位起始产生的,TMV外壳蛋白亚基因组RNA,是TMV识别利用负链RNA中间的亚基因组启动子后产生的,这个启动子位于外壳蛋白读码框5′端256碱基范围之内,但大于48个碱基,虽然TMV能利用单链的负链RNA上的亚基因组启 相似文献
4.
金海翎 《Acta biochimica et biophysica Sinica》1996,28(4):358-366
根据对TMV高效复制和基因表达的顺式作用元件的分析,在体外重组包装了2个缺失型TMV粒子:TMVRP和TMVCP。前者缺失了TMV外壳蛋白CP基因的3′端及后序区域,后者缺失了大部分复制酶基因。把两者分别或共同电击感染烟草原生质体:1.用CP抗体进行免疫印渍检测,单独感染的原生质体内的CP在16小时内无增加,而在共同感染的原生质体内,CP在感染2小时后就开始明显增加。2.用RT一两次PCR法专一地检测新生负链RNA的合成情况,在单独感染的原生质体内没有检测到,但在混合感染的原生质体内在感染1小时后就检测到CP基因特异的负链RNA的形成,并用Southern杂交得到进一步验证。这些结果表明,复制酶缺失型TMVCP内的CP基因不能表达,但可以在TMVRP存在时,通过其所表达的复制酶互补作用得到复制从而有效表达. 相似文献
5.
为了验证转基因烟草中表达的外壳蛋白(CP)能够重新包被侵入的烟草花叶病毒(TMV)的假设,利用抗原表位标记的方法观察CP亚单位在病毒5′端的交换。通过PCR 方法将来源于鼠肝炎病毒(MHV) S蛋白的两个小肽段(11 a.a.和15 a.a.)的DNA序列分别插入TMV-U1 CP基因邻近3′端的两个位点,并构建了带有外源序列的TMV 侵染克隆V9 (11 a.a.)和E15 (15 a.a.)。通过体外转录反应,得到V9 RNA 及E15 RNA。突变病毒RNA 侵染烟草(Nicotiana tabacum )后表现不同特性。V9 和E15 侵染XanthiNN烟草后同野生型TMV一样产生枯斑。但是,当它们侵染Xanthinn 烟草时,V9 产生同侵染XanthiNN 烟草相同的枯斑,而E15的特性同TMV-U1几乎完全相同,能对Xanthinn 烟草进行系统侵染并在叶片中聚集大量的带有外源片段的外壳蛋白,而且病毒的结构极其稳定。V9 和E15 特性的差异可能是由于外源片段在外壳蛋白中存在位置的不同影响了外壳蛋白的结构所致 相似文献
6.
采用PEG沉淀和差速离心的方法提纯雀麦花叶病毒的G和T分离物。利用蛋白酶K和两相酚法制备雀麦花叶病毒的总RNAs。将G和T分离物RNAs进行琼脂糖凝胶电泳,结果发现Br-MV-G除含有正常的RNA组分外,还出现了另一新的RNA_(3b)组分,其分子量为0.50×10 ̄6。RNA_(3b)只出现在大麦寄主中,而在昆诺基上缺失。RNA_(3b)仅依靠于其来源的G分离物的RNAs进行复制。以RNA_(3b)为模板合成 ̄(32)P-cDNA探针,和BrMV-G分离物的RNAs进行分子杂交试验表明:RNA_(3b)属RNA_3的缺陷型组分,它依赖于BrMV-G-RNA_3的帮助才能在大麦寄主中复制。RNA_(3b)的出现和缺失对BrMV的症状表现没有影响。 相似文献
7.
将细胞表面粘附分子CD44S的cDNA反向插入到真核细胞表达载体pMAMneo-CAT和MMTV-LTR启动子下游,构成CD44S的反义RNA载体.将其用电击法导入CD44+的人黑色素瘤细胞系HMM239,转录出的反义RNA能不同程度地抑制HMM239表面CD44的表达.CD44的表达被抑制后,瘤细胞与透明质酸的结合力下降,细胞的体外生长速率不受影响.将其接种裸鼠皮下,发现其致瘤性明显降低 相似文献
8.
反义RNA抑制人黑色素瘤细胞表面粘附分子CD44的表达及抑瘤效应 总被引:2,自引:0,他引:2
将细胞表面粘附分子CD44S的CDNA反向插入到真核细胞表达载体PMAMneo-CAT和MMTV-LTR启动下游,构成CD44S的反应RNA载体,将其用电击法导入CD44的人黑色素瘤细胞系HMM239,转录出的反义RNA能不同程度地换制HMM239表面CD44的表达,CD44的表达被抑制后,瘤细胞与透明质酸的结合力下降,细胞的体外生长速率不受影响,将其接种裸鼠皮下,发现其致瘤性明显降低。 相似文献
9.
反义RNA调节肿瘤细胞O~6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性 总被引:1,自引:0,他引:1
报道了逆转录病毒载体介导的反义RNA对肿瘤细胞O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)活性的调节作用.构建了三个表达MGMT反义RNA的逆转录病毒载体并用它们转染HeLaS3肿瘤细胞,观察细胞在转染前后MGMTmRNA水平、MGMT活性及其对ACNU抗药性的变化.发现针对MGMTmRNA5’端的反义RNA能够有效地降低MGMTmRNA水平和MGMT活性并使细胞对ACNU的敏感性提高4.6倍;针对MGMTmRNA全长的反义RNA也能在一定程度上调节细胞的MGMTmRNA水平和MGMT活性并增加细胞对ACNU的敏感性,而针对3’端序列的反义RNA对MGMT活性没有调节作用. 相似文献
10.
为研究反义RNA表达载体在细胞内的稳定性,构建了一个特异性针对β地中海贫血基因IVS-2-654C→T(β654)突变mRNA前体异常剪接位点的反义RNA表达载体pCMVA.pCMVA转染β654HeLa细胞后,通过RNA定量检测反义片段对β654mRNA异常剪接的纠正作用;再从转染后传代5次并冰冻保存1年的HeLa细胞中回收反义表达载体,转染另外的β654HeLa细胞,同样检测它对β654mRNA异常剪接的纠正作用.结果显示该载体在细胞传代前后均能阻断β654异常剪接,部分恢复其正常剪接途径:用回收的pCMVA转染β654HeLa细胞后,正常剪接的βmRNA水平[β/(β+β*)]由0.05上升到处理后15d的0.48,而2种对照质粒处理后对这一比值影响不大.表明pCMVA可在HeLa细胞中随着细胞传代而传递下去,并保持结构与功能完整 相似文献
11.
日本《农业技术》,1999年54卷4期第7N~11N页报道:甘薯带状粗皮病严重危害甘薯,向甘薯导入SPFMV-S病毒外壳蛋白质基因,可以培育带状粗皮病抗性甘薯。向植物导入基因的方法,一是利用农杆菌(Agrobacterium),在质粒上对夹于25bp的T-DNA两末端序列的目的基因编入植物染色体;二是使用电激、聚乙二醇(Polyethyleneglycol)、粒子枪等直接导入。对于甘薯基因重组的研究情况概要如下。1 向甘薯导入SPFMV-S外壳蛋白质基因1.1 甘薯基因重组方法。一是Agroba… 相似文献
12.
研究了骨形态发生蛋白BMP-2cDNA在COS细胞和小鼠肌肉中的表达的情况,从pSPS65BMP-2质粒中回收BMP-2cDNA,删除5'端的非翻译序列,插入pSVL载体中,构建了含有BMP-2全长编码序列的重组表达质粒pSVLBMP-2。将表达质粒导入COS-7细胞中,细胞RNA点杂交结果表明,转染BMP-2基因的细胞内BMP-2的mRNA水平明显升高;细胞培养上清的ELISA显示,转染BMP-2cDNA后,细胞分泌产生的BMP-2显著增加。小鼠实验发现,在肌肉内用注射法导入BMP-2重组质粒后,局部组织内BMP-2的mRNA转录水平也明显提高。 相似文献
13.
利用RT-PCR方法,从小鼠肝脏组织总RNA中扩增出4.5SRNA的cDNA。该cDNA被克隆到pGEM3Zf(+)质粒上,酶切鉴定并测序。然后将该序列插入以Luc基因作为报道基因的表达载体pSVluc20的PvuⅡ位点,构建了含4.2SRNA逆转座子的表达载体pSVluc20-4.5S。脂质转染法将表达载体导入小鼠骨髓瘤细胞NS-1、SP2/0和人乳腺癌细胞Bca61。结果表明,小鼠4.5SRN 相似文献
14.
一个双价锤头型核酶在体外对两种不同植物病毒RNA的专一切割作用 总被引:1,自引:0,他引:1
根据锤头核酶模型,设计合成了一个以黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白(CP)亚基因组RNA为底物的锤头型核酶(RZC),在证明它能有效切割该底物后,再将这个核酶与一个能专一性切割烟草花叶病毒(TMV)移动蛋白(MP)亚基因组RNA的锤头型核酶(RZ1)相互串联构成了一个双价核酶(RZ1C),体外结果表明,这个双价核酶能与相应的单价核酶RZ1和RZC一样专一而有效地切割CMV CP和TMV MP RNA 相似文献
15.
hBMP—2cDNA在COS细胞和小鼠肌肉中的表达 总被引:4,自引:1,他引:3
研究了骨形态发生蛋白BMP-2cDNA在COS细胞和小鼠肌肉中的表达的情况,从pSPS65BMP-2质粒中回收BMP-2cDNA,删除5端的非翻译序列,插入pSVL载体中,构建了含有BMP-2全长编码序列的重组表达质粒pSVLBMP-2将表达质粒导入COS-7细胞中,细胞RNA点杂交结果表明,转染BMP-2基因的细胞内BMP-2的mRNA水平明显升高,细胞培养上清的ELISA显示,转染BMP-2c 相似文献
16.
本文讨论了检测丙型肝炎病毒核糖核酸(HCVRNA)的样本来源和处理,引物的设计,合成和选择等问题;重点介绍了蛋白酶K消化法,聚乙二醇沉淀法,异硫氰酸胍一步法,硅凝胶提取法和直接捕获法提取HCV RNA的5种方法,以及一步PCR法,常规RT-巢式PCR,直接RT-巢式PCR,化学修饰的RT-巢式PCR,联合PCR,双温PCR和定量竞争性PCR等7种PCR方法检测HCV RNA,用PCR检测HCV RNA方法的标准化以及检测HCVRNA具有非常重要的意义。本文还介绍了一种新型的定量方法-bDNA信号放大技术检测HcVRNA。 相似文献
17.
构建可表达原癌基因c-jun正义和反义RNA的真核细胞表达载体,将其导入体外培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)后,经Northern分析证实,两种插入方向的cjun基因均在VSMC中大量表达; ̄3H-TdR参入实验表明,c-jun反义RNA对VSMC的增殖具有显著抑制作用.提示用反义核酸抑制c-jun表达对治疗某些由于VSMC增殖所引起的心血管病可能具有一定意义. 相似文献
18.
根据锤头核酶模型,设计合成了一个以黄瓜花叶病毒(CMV) 外壳蛋白(CP) 亚基因组RNA 为底物的锤头型核酶(RZC) 。在证明它能有效切割该底物后,再将这个核酶与一个能专一性切割烟草花叶病毒(TMV) 移动蛋白( MP) 亚基因组RNA 的锤头型核酶(RZ1) 相互串联构成了一个双价核酶(RZ1C) 。体外结果表明,这个双价核酶能与相应的单价核酶RZ1 和RZC 一样专一而有效地切割CMVCP和TMV MPRNA。 相似文献
19.
烟草花叶病毒(普通株中国分离物)及其弱毒苗—N14(番茄株)组织 … 总被引:2,自引:0,他引:2
用双脱氧未端经终止法对侵染性烟草共现毒普通株中国分离物(TMV-virlgar,Chinese lsoblate,TMV-Cv)和番茄株弱毒轩TMV-N14(Attenuated TMV vaccine strain)基因组cDNAs的核苷酸全序列进行了测定,并分析和比较了其基因组的结构和特征。结果表明:普通株基因组(Genbank接收号:AF165190)为6395个核苷酸:4个功能性开放阅读框 相似文献
20.
利用HSV—TK基因治疗肝癌的离体研究 总被引:2,自引:1,他引:1
利用DNA重组技术,将HSV-TK基因克隆至逆转录病毒载体(XM-6/TK)。经PA317细胞包装后,转染人肝癌细胞HepG2。结果显示,XM-6/TK转染HepG2细胞与野生型相比,其生长特点和细胞形态未有改变。给予抗病毒药物-环氧鸟苷(Ganciclovir,GCV)后,转染细胞生长受到严重抑制,细胞数量明显降低。细胞学检查证实,GCV处理后,转染细胞的死亡率显著增加。本结果提示,应用HSV-TK基因治疗肝癌可能为一种治疗肿瘤新的方法 相似文献