单克隆抗体亲和层析纯化人白细胞干扰素的研究

本文报道了一种单克隆抗体亲和层析纯化人白细胞干扰素的方法．我们采用自己研制的α－干扰素单克隆抗体亲和层析柱进行了人白细胞干扰素较大规模纯化的研究,结果表明,其活性回收率平均达１０６．９％以上,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ银染法鉴定,白细胞干扰素的大多数活性成分均被吸附和回收,所得的干扰素蛋白成分主要位于分子量１５０００～２１０００Ｄ的干扰素活性区域,产品的纯度大大提高,比活可达８×１０６ＩＵ／ｍｇ;ＥＬＩＳＡ夹心法测定,每毫升洗脱样品中鼠源ＩｇＧ含量小于４ｎｇ,我们所建立起的亲和层析法操作简便,亲和吸附和洗脱条件温和,可适用于大规模的白细胞干扰素的纯化．     

CELLTECH公司可提供抗-γ-干扰素

对γ-干扰素日益感兴趣的一个标志是Celltech公司把抗-γ-干扰素列入了它的单克隆抗体的产品目录。这家英国公司的抗-α-干扰素在世界上的销售十分成功。许多干扰素制造者都是将附在载体粒的单克隆抗体装柱,来纯化α-干扰素的。在不纯的混和物通过柱时,单克隆抗体唯独与α-干扰素结合。杂质流出柱外,附在单克隆抗体上的干扰素仍留在载体粒上。从载体粒提取的即是高度纯化的干扰素。在α-干扰素的室内测定中,单克隆抗体也有用。     

抗人B7-H1单克隆抗体的制备和鉴定

目的:采用杂交瘤技术制备抗人B7-H1单克隆抗体,并对其进行鉴定。方法:经抗原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞以常规方法融合;用间接ELISA法筛选分泌抗体的杂交瘤细胞株;阳性克隆用有限稀释法获得稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;扩增杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔后制备腹水;纯化腹水中的单克隆抗体并对其亚型进行鉴定;用间接ELISA法测抗体效价;将肺癌组织制成石蜡切片,用抗人B7-H1抗体进行免疫组化染色。结果:获得1株稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型为IgG1;抗体效价为1×108,纯化后的抗体含量为6.76g/L;免疫组化实验中,单抗可与肺癌组织表面的B7-H1蛋白特异地结合。结论:制备了人B7-H1单克隆抗体,为B7-H1检测试剂盒的研制奠定了基础。     

抗体分离纯化技术的研究进展

制备高特异性、高效价的抗体是实验免疫学技术的基础,抗体质量的高低,将直接影响试验的成败.抗体的制备有两个途径:一是一般通用的方法,以纯化的抗原免疫动物,获得多克隆抗体;二是应用杂交瘤技术制备单克隆抗体.但不论用何种技术制备的抗体都需要进行纯化.重要的是根据抗体的性质和来源选择一个合适的分离纯化方法.对当前的纯化方法进行了一个简要的综述.     

大型除菌过滤器在重组干扰素生产中的应用

为适应大规模生产的需要,用Millipore293型滤器取代常用的赛氏滤器对重组干扰素α1b及γ进行除菌过滤,此种大型滤器不仅滤膜面积大,而且单位面积过滤量也有明显增加,因此,过滤速度显著加快,可适应大规模生产的应用,用此二种滤器作除菌过滤对干扰素活性无影响,过滤制品前用2%白蛋白预滤可减少滤膜吸附干扰素作用,Millipore和赛氏滤器除菌过滤后热原质均能达到肌肉注射标准,且大部分能达到静脉注射标准,有个别制品用赛氏滤器过滤后热原质达至不到静脉注射标准者,用Millipore滤器复滤后,可以合格,上述结果表明用Milli-pore293型滤器制备重组干扰素α1b及γ是切实可行的。     

重组人干扰素α2b的提取和纯化

为了提高重组人干扰素α2b的质量 ,增加产量 ,降低成本 ,通过破菌 ,包涵体提取 ,离子交换层析 ,凝胶过滤等纯化方法制备干扰素纯品。结果表明干扰素纯度可达 95%以上 ,比活达到 1.2× 10 8IU/mg以上。结果提示 ,采用本方法收率高 ,纯度好 ,工艺稳定 ,适合大规模生产     

从混合的噬菌体抗体库中直接筛选高亲和性的抗肿瘤坏死因子-α人源单克隆抗体

采用噬菌体抗体库技术,从未经免疫的混合人噬菌体抗体库直接筛选抗ＴＮＦα的人源单克隆抗体,３种不同的检测手段表明,经过５轮的筛选,能够与ＴＮＦα结合的噬菌体抗体得到了有效的富集。对所获得的噬菌体抗体克隆进行的初步鉴定表明,７个噬菌体抗体克隆能有效地与人重组ＴＮＦα结合,并且这种结合具有特异性,由这７个噬菌体抗体克隆制备的抗体Ｆａｂ片段也能有效地与ＴＮＦα结合。由此,我们通过噬菌体抗体技术直接获得了ＴＮＦα的人源单克隆抗体,这为进一步制备具有临床应用前景的人源抗ＴＮＦα单克隆抗体打下了基础。     

人突触小体相关蛋白25单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备抗人突触小体相关蛋白25(SNAP25)的鼠源单克隆抗体。方法:利用大肠杆菌表达SNAP25蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠制备杂交瘤细胞,筛选针对SNAP25的阳性杂交瘤细胞株,鉴定抗体亚型;用杂交瘤细胞株制备腹水单抗,纯化后利用SDS-PAGE检测抗体纯度。结果:表达并纯化得到纯度大于90%的SNAP25蛋白,免疫小鼠后经2轮筛选得到12株阳性杂交瘤细胞株,其中抗体重链包括IgG1、IgG2型,轻链大部分为κ链;选择具有相对较高抗原结合活性的14号杂交瘤细胞株制备腹水,纯化后得到纯度大于90%的抗体。结论:获得1株高纯度的针对SNAP25的鼠源单克隆抗体,为肉毒毒素的检测奠定了基础。     

抗流感病毒单克隆抗体CR6261在糖基工程酵母中的表达及分析

目的:在糖基工程酵母中表达抗流感病毒单克隆抗体CR6261,并对其进行结构分析和活性测定。方法:从GenBank获得CR6261抗体的全基因序列,构建轻重链表达载体pPICZα-CR6261-H-L,电转入糖基工程酵母,利用甲醇诱导型启动子AOX1表达CR6261抗体蛋白,通过SDS-PAGE、Western印迹筛选表达菌株,用Protein A亲和层析、Superdex200凝胶过滤柱分离纯化抗体蛋白,应用ELISA方法对纯化后的蛋白进行活性鉴定。结果:CR6261抗体蛋白分泌在培养上清中,且纯化后的蛋白与糖基工程酵母表达的流感病毒血凝素蛋白HA5、HA7有结合活性,与商业化三价流感病毒裂解疫苗亦有结合活性。结论:实现了抗流感病毒单克隆抗体CR6261在糖基工程酵母中的表达,并初步检测了其广谱活性,可为酵母表达抗体蛋白药物制备提供参考,ELISA初步评价还显示了其在诊断上的应用前景。     

CD14蛋白表达、纯化及单克隆抗体制备

摘要 目的：制备CD14重组蛋白及抗CD14单克隆抗体。方法：从人外周血淋巴细胞中克隆CD14编码基因,将其连接至质粒pRSETC,构建表达质粒pRSETC/CD14,转染大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),筛选阳性克隆、用IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测CD14蛋白表达水平,应用镍柱进行亲和纯化,SDS-PAGE及Western blot进行纯化产物鉴定。纯化后的CD14蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术筛选分泌单克隆抗体细胞株,制备单克隆抗体,利用Western blot鉴定抗体活性。结果：获得CD14编码基因,并成功进行了原核表达,SDS-PAGE显示CD14以包涵体形式表达,纯化产物的纯度超过95%。利用杂交瘤技术筛选出稳定分泌抗CD14抗体的细胞株,并制备了高纯度的单克隆抗体,抗体具有CD14蛋白结合活性。结论：成功表达纯化了CD14蛋白,并制备了抗CD14单克隆抗体,为后续开发CD14检测技术提供抗体。