大肠杆菌苏氨酸操纵子的体内克隆和诱变

报道了产1.2%大肠杆菌菌株的选育、野生型苏氨酸操纵子的体内克隆、体外再克隆、再克隆的体外诱变以及苏氨酸克隆pTHR12-9-1的获得.还研究了产酸克隆对产酸受体产苏氨酸的影响.发现pTHR12-9-1对低产菌有增产效应,对高产菌则相反;并对此现象作了讨论.     

枯草芽孢杆菌核黄素操纵子rib operon的克隆与表达

目的:构建产核黄素的枯草芽孢杆菌基因工程菌.方法:以穿梭载体pEB03构建核黄素操纵子的表达质粒载体pGJB13和pGJB14,与质粒pMX45分别转化产核黄素的枯草芽孢杆菌GJ07,并通过发酵摇瓶实验检测核黄素的产量.结果:得到产核黄素的工程菌GJ13 、GJ14和GJ08,在以蔗糖为碳源的发酵条件下,GJ08可产核黄素820mg/L,提高了约55%.结论:得到了产核黄素的高产菌种G J08.     

紫外线诱变原生质体选育苏氨酸高产菌株

以黄色短杆菌T6-13的苏氨酸产生菌GSR8-25为出发菌株,利用溶菌酶制备其原生质体后进行紫外线(UV)诱变处理,从再生株中筛选出苏氨酸高产菌株。经多次连续诱变处理得到一苏氨酸高产菌株25-20,在含10%葡萄糖的培养基中摇瓶发酵60小时可积累苏氨酸19.5mg/ml。分离纯化后得菌株25-202,其苏氨酸产量可达21.5mg/ml,比出发菌株提高43.3%。     

真核生物的操纵子

真核生物的操纵子关键词真核生物,线虫,操纵子人们已知,细菌基因是组成操纵子并转录成多顺反子ｍＲＮＡ的,真核生物基因则受各别调控并转录成单顺反子ｍＲＮＡ。但ＴｏｍＢｌｕｍｅｎｔｈａｌ领导的研究组于１９９３年宣称,线虫Ｃａｅｎｅｒｈａｔｄｉｔｉｓｅｌｅｇ...     

含苏氨酸操纵子重组质粒的构建及其对大肠杆菌L-苏氨酸积累的影响

摘要：【目的】通过分子生物学手段构建重组质粒,将其转入野生型大肠杆菌W3110,分析含苏氨酸操纵子基因的质粒及质粒定点突变解除反馈抑制时,对L-苏氨酸积累的影响。【方法】以W3110染色体DNA为模板,PCR扩增苏氨酸操纵子基因,即启动子THrLp、编码前导肽基因thrL以及thrA、thrB、thrC基因,通过重叠延伸PCR的方法对thrA基因定点突变,解除苏氨酸对它的反馈抑制,构建出重组表达质粒WYE112和WYE134,5 L发酵实验测定L-苏氨酸的产量。【结果】经5 L发酵罐发酵产酸实验,W3110的L-苏氨酸产量为0.036 ± 0.004 g/L,携带含苏氨酸操纵子质粒的W3110菌株L-苏氨酸产量为2.590 ± 0.115 g/L,质粒上thrA解除反馈抑制后,L-苏氨酸的产量增加到9.223 ± 1.279 g/L。【结论】过表达苏氨酸操纵子基因可以使L-苏氨酸积累,进一步解除thrA基因的反馈抑制,可以增强L-苏氨酸积累的效果,为L-苏氨酸工程菌改造的进一步研究奠定了基础。     

木醋杆菌纤维素合成操纵子的克隆及棉花转化

革兰氏阴性菌木醋杆菌(Acetobacter xylinum (Brown) Yamada)合成一种由纤维素微纤丝组成的胞外带状物.与高等植物纤维素相比,它具有独特的结构和机械性能.根据从木醋杆菌ATCC 53582克隆的acs纤维素合成操纵子序列设计引物, 用PCR的方法从木醋杆菌Ay201中克隆了ayacs纤维素合成操纵子的全部4个基因.序列比较发现,两者高度同源.将连上CaMV 35S启动子的acsA、acsB克隆到植物表达载体pCAMBIA 1301上,acsC、acsD克隆到pCOB302-3中.然后通过花粉管通道法转化棉花(Gossypium hirsutum)胚珠,收获的种子在含有卡那霉素和除草剂的双抗培养基上进行筛选.PCR检测发现934粒种子中有5棵植株含有全部4个基因.这是首次将编码4个功能蛋白的细菌操纵子成功地转入棉花.     

关于色氨酸操纵子的概念

关于色氨酸操纵子,在杨颐康先生主编的《微生物学》一书中是这样叙述的:“在色氨酸操纵子里,由调节基因产生的调节蛋白,本来不具阻遏蛋白活性,但与色氨酸结合后,由于构象变化,就具有与DNA的亲和力,而结合在DNA上,这样就使结构基因关闭,不可能产生色氨酸”。又如《基础微生物学专题选》(复旦大学“基础微生物学专题选”编写组)一书中用     

高产人参寡糖素培养细胞克隆系的诱变筛选

紫外辐射能显著地降低人参培养细胞单细胞克隆的植板率。当紫外辐射悬浮细胞３０ｓ后,细胞克隆的植林率是对照组的２１．４３％。细胞克隆平板培养６０ｄ,挑取克隆连续转移培养３次,共获得克隆系１２２株。对所有克隆系进行变异分析并经１０代连续继代培养,从中筛选到一株稳定的高产寡糖素克隆系ＰＧＵＡ－０８,而且它的过氧化物酶同工酶谱特征也保持稳定。克隆系ＰＧＵＡ－０８的生长速率为０．５３７ｇＤＷＬ－１ｄ－１,是亲本的１．４６倍,寡糖素含量为１７．１６％ＤＷ,是亲本的１．８１倍,寡糖素产率为２．７６４ｇ／Ｌ,是亲本的２．６２倍。     

木醋杆菌纤维素合成操纵子的克隆及棉花转化

革兰氏阴性菌木醋杆菌 (Acetobacterxylinum (Brown)Yamada)合成一种由纤维素微纤丝组成的胞外带状物。与高等植物纤维素相比 ,它具有独特的结构和机械性能。根据从木醋杆菌ATCC 5 35 82克隆的acs纤维素合成操纵子序列设计引物 ,用PCR的方法从木醋杆菌Ay2 0 1中克隆了ayacs纤维素合成操纵子的全部 4个基因。序列比较发现 ,两者高度同源。将连上CaMV 35S启动子的acsA、acsB克隆到植物表达载体pCAMBIA 130 1上 ,acsC、acsD克隆到pCOB30 2_3中。然后通过花粉管通道法转化棉花 (Gossypiumhirsutum)胚珠 ,收获的种子在含有卡那霉素和除草剂的双抗培养基上进行筛选。PCR检测发现 934粒种子中有 5棵植株含有全部 4个基因。这是首次将编码 4个功能蛋白的细菌操纵子成功地转入棉花     

色氨酸操纵子研究进展

色氨酸只能由微生物和植物合成。催化色氨酸分支途径的酶由色氨酸操纵子编码。生物体内色氨酸合成受到严格调控,色氨酸操纵子发挥重要作用。本文综述色氨酸代谢途径及其调节,并对途径工程在色氨酸操纵子改造中的应用进行回顾。     

大肠杆菌K99菌毛fan操纵子的克隆、表达及活性

[目的]在体外克隆和表达猪产肠毒素大肠杆菌(ETEC) K99菌毛操纵子fan结构基因,并检测重组菌毛的相关生物学活性.[方法]以猪源分离的表达K99菌毛ETEC C83907株制取模板,成功PCR扩增出编码K99菌毛的fan操纵子,约5.7 kb.将fan操纵子克隆人表达质粒载体pBR322,筛选出含正确阳性质粒的重组菌.进一步将上述的重组质粒DNA转化至不含任何菌毛的大肠杆菌SE5000株,同时将空载体pBR322质粒转化入SE5000构建阴性对照菌株.[结果]该重组菌能与鼠抗K99菌毛单克隆抗体发生明显的凝集反应,与新生仔猪小肠上皮细胞刷状缘BBV分子有强烈凝集反应.电镜观察到上述重组菌表面大量表达K99菌毛,用热抽提法提纯其表达的K99菌毛,并经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色,可以得到分子量约为18.5kDa的主要蛋白条带.纯化菌毛免疫小鼠后制备出高效价的鼠抗血清,能与携带K99菌毛的C83907、C83914、C83260野生株发生强烈的凝集反应,而与携带其他菌毛的ETEC不反应.玻板凝集试验和Western blot结果表明:体外表达的K99菌毛具有和野生K99菌毛相同的抗原性.用表达K99菌毛的重组菌进行HeLa细胞体外黏附试验和黏附抑制实验,结果表明:重组菌和野生菌株一样具有较强的粘附性,而且用重组菌毛制备的鼠抗血清能有效地抑制上述重组菌或野生菌株对细胞系的黏附结合.[讨论]本研究为进一步研究K99菌毛生物学作用建立了良好的实验平台.     

大肠杆菌棉子糖操纵子

大肠杆菌(Escherichiacoli)棉子糖(raf)操纵子位于质粒,它编码能够使大肠杆菌吸收和利用三糖棉子糖的蛋白,即一个主动运输系统(Raf透性酶),α半乳糖苷酶和蔗糖水解酶。raf操纵子包括启动子rafP,调节基因rafR,操纵基因rafO以及rafA,rafB,rafD三个结构基因。这个操纵子由一个阻遏蛋白RafR负控制,同时以环腺苷代谢降解物基因激活蛋白(cAMPCAP)为中介的正调控也参与调节。     

枯草芽孢杆菌MH25 Iturin A操纵子的克隆与分析

根据已知非核糖体肽合成抗生素操纵子的保守序列设计引物,从对棉花立枯病有很好拮抗作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MH25菌株中克隆相关操纵子.获得了枯草芽孢杆菌MH25的一个非核糖体肽合成抗生素操纵子序列,其包括4个ORF(ORF1,ORF2,OKF3,ORF4),与枯草芽孢杆菌RB14的ituD,ituA,tiuB和ituC的同源性分别为99%,98.70%,98.99%和99.48%,4个ORF编码的氨基酸序列与ItuD,ItuA,ItuB,ItuC的相似性分别为98%,98.54%,98.69%和98%.然后将4个ORF分别进行结构域分析,ORF3的14 779～14 963序列与ituB相对应区域的相似性为86.24%.该操纵子的启动子区为TATACACA-16bp-TAGGAT,与σA-10和-35(TTGACA-17bp-TATAAAT)不同.枯草芽孢杆菌MH25的Iturin A操纵子序列已在GenBank中注册,登陆号为EU263005.     

苏氨酸醛缩酶的研究进展

苏氨酸醛缩酶(TAs)以磷酸吡哆醛为辅酶,催化不同的醛与α-氨基酸发生醇醛缩合反应,形成具有2个手性中心的β-羟基-α-氨基酸。TAs在不对称催化过程中可以控制产物α-碳位的立体构型,而对β-碳位的立体构型控制相对较弱。增强TAs在β-碳位的立体选择性是近年来研究TAs不对称催化的热点。本文重点阐述了TAs的结构与作用机制、定向进化,以及在生物催化合成中的应用,对TAs的研究与开发进行了展望。     

色氨酸操纵子调控机理详析

色氨酸操纵子是最早被研究的细菌合成代谢调控、基因表达调控的模型之一。其中阻遏蛋白对转录起始的抑制作用、色氨酸作为辅阻遏物的作用以及通过定点突变揭示的弱化作用的分子机制已基本被阐明。此外,色氨酸操纵子RNA结合弱化蛋白、NusA、NusG、TrpY等调节蛋白对细菌色氨酸操纵子弱化作用的调节机制也在近年来得到进一步揭示。特别是在枯草芽孢杆菌中,色氨酸操纵子主要依赖于转录衰减机制调控,包括由色氨酸激活的色氨酸操纵子RNA结合弱化蛋白与新生转录产物结合形成内部终止子,导致5′非翻译区（5′UTR）转录终止。NusA、NusG通过刺激RNA聚合酶在5′UTR的U107和U144位点暂停,释放出RNA聚合酶,最终造成转录终止。不同的是,在U144位点NusA参与的转录弱化机制依赖其发夹结构,且NusA与RNA聚合酶作用促进了RNA结合弱化蛋白与新生转录产物的结合,使转录终止。而NusG是通过与非模板DNA链中的一段富含T碱基序列和RNA聚合酶同时互作,阻止了RNA聚合酶向下游移动,从而引起RNA聚合酶高效停滞。但在细菌操纵子中,绝大多数调节因子参与的弱化机制最终依赖于ρ因子,从而导致多达一半的转录终止事件发生。近年来,随着学科的发展,越来越多关于色氨酸操纵子调节机制新概念被挖掘报道,这也使人类对色氨酸操纵子的表达调控机制的认知愈加详尽。     

合成苏氨酸的研究（Ⅳ）DL—苏氨酸的光学拆分

本文研究了用优先结晶法拆分ＤＬ－苏氨酸的有关问题,诸如（Ｌ－Ｔｈｒ＋Ｄ－Ｔｈｒ＋Ｈ２Ｏ）三元体系溶解度数据、”平液“及”贫液“拆分问题,拆分速度对晶种的依存、过饱和度的选择、连续拆分设想及间歇拆分示例等,为工业化过程提供了重要的实验依据。     

蜡样芽孢杆菌ATCC14579核黄素操纵子的克隆及在枯草芽孢杆菌中的表达

利用BLAST从B．cereus ATCC14579的基因组中找到一段与枯草芽孢杆茵核黄素操纵子具有较高相似性的4．6kb大小的基因组DNA片段,该片段中含有完整的核黄素操纵子。该操纵子结构基因的编码产物的氨基酸序列与枯草芽孢杆菌核黄素操纵子相应结构基因的编码产物的氨基酸序列具有99％的同源性。该片段被克隆到大肠杆茵一枯草芽孢杆茵穿梭载体pHP13M中。表达分析的结果表明B．cereus ATCC14579核黄素操纵子可在大肠杆茵和枯草芽孢杆菌中表达。利用PCR方法用来自枯草杆菌的sac B基因的启动子替换B．cereus ATCC14579核黄素操纵子原有的启动子使其更好表达。替换启动子后的核黄素操纵子在本文使用的发酵条件下有较好的表达,核黄素产量从39．5mg／L增加到61．7mg/L.     

合成苏氨酸的研究（Ⅴ）—DL—别苏氨酸的光学拆分

研究了用优先结晶法对ＤＬ－别苏氨酸进行光学活性拆分的问题，在相图基础上选取适当的过饱和度，即配制成原始拆分母液。作为品种，既可用光活性别苏氨酸，也可用光活性苏氨酸。可用对映的一对光活性晶种，还介绍用单一晶种的拆分方法，提出了Ｌ－别苏氨酸 Ｌ－苏氨酸，Ｄ－别苏氨酸与Ｄ－苏氨酸为“胶着对”Ｌ－别苏氨酸与Ｄ－苏氨酸，Ｌ－别苏氨酸与Ｄ－苏氨酸为“离散对”的观点。