直接施用病毒载体加速基因治疗

用基因疗法不仅直接治疗遗传病,也治疗心脏病和癌症,这一天的到来由于密执安大学研究人员的重要进展,比人们预期的要早得多.科学家们选定了一根血管的特定部位,将遗传设计的病毒送至该区域,使病毒侵染血管壁细胞,直到几个月后,被侵染细胞产生了病毒基因编码的蛋白.更令人高兴的是,科学家Elizabeth Nabel、Gregory Plautz和Gary Nabel发现,上述过程仅局限于那个特定的部位;无论是病毒还是侵染细胞都没有扩展到选定区域以外.     

引起普通肾癌的基因

国立癌症研究所(NCI) (Bethesda,MD)已经发现了一种突变基因,据信该基因能够引起被称之为散发性明细胞癌这一最普通型的肾癌。象许多其它有疑问的致癌基因一样,该基因在功能正常时具有肿瘤抑制基因的作用。由该基因编码的蛋白似乎能抑制细胞复制。在一组患有肾脏明细胞癌的家族中,NCI发现有57％的患者体内该基因的二种拷贝均失活。     

昆虫病毒的增强蛋白

在某些昆虫病毒的包涵体中相继发现了增强蛋白．这类蛋白可以增强核型多角体病毒对昆虫幼虫及体外培养的昆虫细胞的感染力,缩短杀虫时间,提高杀虫效率;还可以增强其他生物杀虫剂（如：Bt）的毒力．关于增强蛋白的作用机制有两种观点：降解围食膜以利于病毒粒子侵染细胞或直接作用于细胞质膜促进病毒粒子的套膜与之融合．该蛋白是由病毒编码的,现已克隆出第一个增强蛋白基因,该基因含有一个2703bP的开放阅读框,其核苷酸序列分析业已完成．增强蛋白的发现有望对病毒杀虫剂的推广产生积极影响．     

新型蛋白质选择性干扰抑癌基因

科研人员发现的一种新型蛋白质可以选择性地参与抑癌基因p53的活性调控,他们为这种蛋白质取名为Apak。当Apak与p53结合时,抑癌基因不会伤及正常细胞,而当正常细胞遇到基因组损伤信号时,Apak与p53迅速分离,释放出p53的杀伤细胞功能,从而及时清除掉对机体带来危害的部分“变坏”细胞,大大降低了肿瘤发生的风险。这次发现的Apak隶属于锌指蛋白家族,该家族中很可能存在大量没被发现的p53调控蛋白,     

香蕉枯萎病菌4号生理小种致病相关基因foABC1的分离

通过对香蕉枯萎病菌4号小种致病突变体B1233的进一步研究,分离了被突变的致病相关基因foABC1,同源性分析及保守结构预测该基因编码一类ABC转运蛋白,其功能可能同稻瘟病菌的ABC转运蛋白一样,负责真菌毒素的泵出,或是像其他真菌的ABC转运蛋白,在病原菌侵染寄主植物时能忍耐植物因防卫反应所释放的植保素或抗毒素类物质。     

可使植物抗任意病毒的单基因

Scripps Research Institute(La Jolla CA)和加州大学Riverside(Riverside,CA)的科研人员发现了一种可使植物抗多种不同病毒的单一蛋白质基因。该基因编码一种“移动基因”的缺陷文本,     

大鼠高血压相关基因表达蛋白抑制血管平滑肌细胞增殖

大鼠高血压相关基因 ( r HRG- 1 )编码一新细胞内信号传递蛋白 .体外转染 r HRG- 1表达蛋白发现 r HRG- 1表达蛋白能抑制自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞内 Raf蛋白 ( Raf- 1 )和丝裂素活化蛋白激酶 ( MAPK)活性 ,抑制抗细胞凋亡基因 ( bcl- 2 )和增殖细胞核抗原 ( PCNA)基因 m RNA表达 ,同时还抑制该细胞 DNA的合成 .r HRG- 1是一正常血压大鼠血管平滑肌细胞内高度表达的基因 ,由此推测在自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞内转染 r HRG- 1表达蛋白抑制其细胞 DNA合成的作用可能是抑制细胞内 Raf- 1活性与 MAPK活性及抑制 PCNA和 bcl- 2基因表达的结果     

猪流行性腹泻病毒经其附属蛋白抑制细胞凋亡

【背景】orf3位于猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) s基因与e基因之间,是目前发现的PEDV唯一一个附属基因,编码附属蛋白(ORF3蛋白)。我们前期研究初步发现ORF3蛋白对PEDV诱导的细胞凋亡有影响。【目的】研究ORF3蛋白在PEDV侵染复制过程中的毒力作用机制。【方法】实验用3种PEDV:rDR13att-?ORF3 (orf3基因全部敲除)、DR13-ORF3att (携带有C端截短orf3)、rDR13att-ORF3wt(携带全长orf3基因)感染Vero细胞,观察病变情况,再用活细胞成像仪、流式细胞仪、 DNA断裂的原位末端标记法[terminaldeoxynucleotidyltransferase(TDT)-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL]等方法检测不同感染时间点的细胞凋亡情况,然后用蛋白质印迹方法分析PEDV感染宿主细胞中主要凋亡相关蛋白(如Caspase-3)的活化或裂解,最后进行转录组测序研究病毒感染细胞中差异基因的表达情况,再用荧光定量PCR验证转录组结果。【结果】rDR13att-?ORF3引起较多的细胞病变,活细胞成像仪的动态观察结果显示,3种病毒侵染的细胞凋亡水平随着时间的延长均高于正常阴性细胞,但敲除orf3的病毒感染细胞后细胞凋亡率比其他两种病毒更高;敲除orf3病毒感染细胞凋亡率显著高于其他两种病毒;病毒rDR13att-?ORF3感染细胞后TUNEL阳性细胞数比DR13-ORF3att和rDR13att-ORF3wt更多;表达ORF3蛋白的重组PEDV可以抑制Caspase-3的活化;ORF3蛋白对受感染细胞Heat shock 70 kD protein 1B (HSP70)基因转录有促进作用,荧光定量PCR结果表明rDR13att-ORF3wt感染细胞的HSP70表达量高于rDR13att-?ORF3感染细胞。【结论】PEDV通过ORF3蛋白抑制细胞凋亡,而且这种作用可能是通过抑制Caspase-3的活化或增加HSP70的产生来完成的。     

MS基因缺失的发现

衣阿华大学(Iowa City,IA)和法国的科研人员发现,第17条染色体上缺失adhalin基因可引起严重型儿童常染色体退行性肌营养不良(SCARMD)。该病能引起严重的随意肌功能丧失。 基因的缺失能导致肌蛋白adhalin的缺乏,该蛋白能在肌肉受损害收缩过程中保护肌肉细胞。受此病折磨的患者第17条染色体上缺失2个adhalin基因,它们分别来自患者的双亲。在不久的将来,将通过基     

植物细胞壁松弛蛋白——膨胀素

膨胀素(expansin,也称作扩张素或扩张蛋白)是一种引起植物细胞壁松弛的蛋白质,在植物细胞伸展以及一系列涉及细胞壁修饰的生命活动中起着关键作用。膨胀素由多基因家族编码,目前的研究表明膨胀素超家族由4个基因亚家族构成。膨胀素存在于不同的种属植物中,并克隆了大量的扩张蛋白基因。综述了近年来国内外有关膨胀素基因和蛋白的结构特征及作用机制等方面的研究进展。     

肠道病毒71型(EV71)荧光病毒的构建

人肠道病毒71型(Enterovirus,EV71)是引起手足口病的主要病原体。首先利用反向遗传学的方法,构建了EV71全长cDNA感染性克隆,经体外转录、转染RD细胞后成功获得了拯救病毒。随后,将增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)插入到EV71基因组中构建荧光病毒。结果表明,此荧光病毒不仅可以侵染、复制,在传代的过程中EGFP基因也保持了较好的稳定性,表明其可以作为一种报告病毒应用于高通量的EV71抗病毒药物筛选中。     

BST-2抑制HIV-1病毒样颗粒释放的研究

BST-2是最近发现的可以抑制成熟HIV-1(human immunodeficiency virus,HIV)病毒颗粒从哺乳动物细胞表面释放的宿主因子,随之发现其也可以抑制多种包膜病毒的释放。本研究采用密码子优化的表达HIV-1 gag和gag-pol蛋白的质粒所形成的病毒样颗粒作为研究对象,观测BST-2对这两种病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)的释放抑制情况及其作用机制。结果发现,瞬时表达和稳定表达的BST-2均可以显著抑制病毒样颗粒从哺乳动物细胞释放,同时发现这两种病毒样颗粒(gag/gag-pol)的释放都可以被BST-2抑制;而且,HIV-1中Vpu蛋白可以拮抗BST-2抑制HIV病毒样颗粒释放的作用,另外,通过化学试剂和酶学方法处理,确证BST-2可以被包装进病毒样颗粒中。     

束缚蛋白抗HIV机制

束缚蛋白(tetherin)是一种具有特殊功能的蛋白质,它可抑制包膜病毒从感染细胞中释放。研究发现,人的束缚蛋白可将新生的HIV-1病毒颗粒固定在细胞表面,同时,它还可以减小HIV-1子代病毒的传染性。本文将主要从分子结构、抗HIV-1病毒的作用机制和在HIV传播中的作用三方面来阐述束缚蛋白抗病毒作用的最新研究进展。     

生物素化FOXM1真核表达体系的构建及鉴定

建立基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达载体,利用生物素与链霉亲和素的高特异性、高亲和力的结合性质对FOXM1蛋白进行纯化,为后续鉴定其互作分子的研究奠定基础。分别构建真核表达载体pc DNA3.1-AP-FOXM1和大肠杆菌生物素连接酶Bir A真核表达载体pcDNA3.1-Bir A,将pcDNA3.1-AP-FOXM1和pcDNA3.1-BirA共转染人胚肾293T(HEK293T)细胞,用银染及Western印迹检测细胞裂解液,确定相关蛋白表达;用链霉亲和素琼脂糖珠纯化生物素标记的FOXM1,并考察FOXM1的互作蛋白是否可以同时被洗脱下来。研究发现构建的生物素标签真核表达体系能有效表达生物素化的目标蛋白FOXM1;该蛋白在Western印迹、pull-down等实验中可实现无需抗体的一步法应用;该体系可用于FOXM1互作蛋白的鉴定和功能分析。结果表明建立了基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达体系,为FOXM1互作蛋白与功能的深入研究奠定了技术基础。     

噬菌体内溶素的酶学特性及其应用前景

噬菌体内溶素是噬菌体在入侵宿主菌及侵染后期释放过程中合成的一类酶蛋白,该蛋白质能够破坏宿主细胞壁肽聚糖层。噬菌体编码的内溶素有四种类型:葡糖苷酶、酰胺酶、肽链内切酶和转糖基酶。大部分噬菌体内溶素由于缺少信号肽无法分泌表达,通常需要另外一种噬菌体编码的穴蛋白(holin)破坏细胞膜,然后才能够进入到细胞周间质裂解细菌细胞壁。大部分噬菌体内溶素可以特异地作用于自身宿主菌,同时也可以利用基因工程手段有目的地改造成功能特异的酶蛋白,因此可以用来作为生物制剂预防及控制微生物感染。     

突触素Ⅰ的若干研究进展

突触素Ⅰ(synapsin Ⅰ)是神经元特有的一类与小型突触囊泡外侧相连的磷蛋白.该蛋白在进化过程中是比较保守的,其基因位于X染色体上.通过基因重组产生的小鼠Synapsin Ⅰ基因的零突变及脑片电生理学的观察,发现synapsin Ⅰ在神经递质释放及突触可塑性等生理活动过程中具有重要作用.     

大麦黄矮病毒GAV株系ORF4基因在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达及亚细胞定位

根据已报道的大麦黄矮病毒GAV株系(BYDV-GAV)相关基因序列,利用RT-PCR方法获得ORF4基因。在杆状病毒-昆虫细胞系统中,成功表达了ORF4和GFP(绿色荧光蛋白)的融合蛋白(GFP:ORF4),Western blot检测到目的蛋白的表达。利用激光共聚焦显微镜观察其在细胞中的积累和亚细胞分布,发现ORF4基因编码的17kD蛋白(P4)能进入细胞核,并在细胞核膜上聚集。通过对ORF4基因编码的P4蛋白的N端和C端缺失突变结合蛋白质的结构预测分析,鉴定出N端α螺旋结构对于P4蛋白的核膜定位是必需的。这些结果为进一步研究ORF4基因在黄矮病毒GAV系统侵染中的生物学功能奠定了基础。     

刺槐核糖体蛋白同源基因RpRPL22在共生结瘤过程中功能研究

目的: 核糖体蛋白(RPs)属于多功能蛋白,能够参与调控细胞生长和响应胁迫条件。RpRPL22是一个从豆科植物刺槐中分离得到的结瘤相关基因,通过序列比对发现其与核糖体大亚基蛋白RPL22高度同源。对其如何通过调控根瘤菌侵染而在共生结瘤过程中发挥重要作用进行了较为深入的探索。方法: 利用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)分析RpRPL22在接菌后不同时间及不同植物组织的表达变化。利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得目的基因cDNA全长。通过GFP报告基因进行RpRPL22亚细胞定位分析。通过Gateway BP重组技术构建RNA干扰(RNAi)重组载体,借助电转化法将重组载体转至农杆菌K599,利用农杆菌介导植物根部,接菌后观察和测量植株表型。首先从宏观水平统计观察目的基因是否对结瘤过程有影响,其次从分子水平揭示目的基因在共生结瘤过程的重要功能。结果: 不同接菌时期、不同植物组织目的基因qRT-PCR相对表达量结果显示,几乎在所有取样的接菌时间,目的基因RpRPL22在接菌根中的相对表达量都低于未接菌对照根,只有接菌后第25天除外。在成熟的根瘤中,接菌后第25天该基因的表达量也最高。洋葱表皮和毛状根亚细胞定位结果均显示在椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子控制下,RpRPL22融合绿色荧光蛋白GFP的荧光信号在细胞核和细胞质有明显的表达。RNAi转化植株的表型统计观察结果,比如植株鲜重、植株的有效结瘤数目较对照组均有明显的降低;同时RNAi转化植株在根瘤菌侵染过程形成的侵染线数目和根瘤原基数目较对照均显著降低。根瘤切片实验用于观察根瘤显微超微结构,结果显示RNAi植株根瘤中固氮区的受菌侵染细胞数目与对照相比明显减少。电镜观察根瘤单个受菌侵染细胞中类菌体形态显示,RNAi根瘤中类菌体侵染细胞胞体多呈不规则形状,皱缩变形严重,环类菌体周间隙空间增大,多共生体融合,表现出细胞凋亡的迹象。对照根瘤中的受菌侵染细胞胞体多呈圆形椭圆形,胞质饱满丰富且分布均匀,细胞发育正常,表明RNAi植株根瘤发育过程明显受阻。结论: 核糖体蛋白(RP)能够参与调控豆科植物共生结瘤过程,相关同源基因RpRPL22可能在起始根瘤菌侵染植物和阻止类菌体降解过程中起重要作用。     

表达萤光素酶的HIV药物筛选细胞模型的建立

目的:构建基于萤光素酶的单次复制人免疫缺陷病毒(HIV)细胞模型,用于抗HIV药物的筛选。方法:构建含萤光素酶报告基因的假型慢病毒质粒,将疱疹性口炎病毒外膜糖蛋白(VSV-G)的表达质粒、HIV-1 Rev蛋白表达质粒、HIV Gag-Pol蛋白表达质粒和含萤光素酶报告基因的重组慢病毒质粒共转染HEK 293FT细胞,制备假型慢病毒;在假型慢病毒生产和再感染新鲜HEK 293FT细胞的过程中加入逆转录酶和蛋白酶抑制剂(如AZT),检测再感染的细胞中萤光素酶的表达水平,从而判断药物对HIV的抑制作用。结果:构建了含萤光素酶报告基因的重组慢病毒质粒pLenti-Luc;利用已知抗HIV药物AZT进行测试,发现HIV药物处理组细胞中萤光素酶活性远低于对照组。结论:建立了基于萤光素酶的HIV药物筛选细胞模型,该系统使用单次复制的报告病毒,具有良好的安全性,而使用萤光素酶基因作为报告基因使该系统具备极高的敏感性,该系统适合于进行高通量药物筛选。     

人eRF3a与survivin相互作用的结构域分析

第二类肽链释放因子eRF3(eukaryotic polypeptide release factor)是一种GTPase,它促进第一类肽链释放因子eRF1的释放活性,并与细胞周期调控、细胞骨架组装、细胞凋亡和肿瘤形成等过程相关。哺乳动物细胞中eRF3有两种——eRF3a和eRF3b,分别由GSPT1和GSPT2(G1 to S phase transition 1/2)基因编码。生存素(survivin)是迄今发现的最强有力的凋亡抑制因子,具有独特的结构和复杂的功能,不仅可以抑制细胞凋亡,还参与细胞有丝分裂、血管的生成等过程。eRF3和survivin都与细胞周期和细胞凋亡的调控相关。该实验室的前期研究表明,eRF3和survivin具有相互作用关系。该研究进一步对eRF3a进行截短突变,采用酵母双杂交和pull-down两种分析方法依次验证eRF3a(1-72aa)和eRF3a(1-36aa)与survivin的相互作用关系。结果表明,eRF3a(1-72aa)和eRF3a(1-36aa)均可以与survivin相互作用,由此确定eRF3a与survivin相互作用的最小结构域位于其N末端1-36aa之间,从而为进一步证实eRF3a的N端结构域与survivin协同作用参与细胞周期和细胞凋亡的调控提供了数据支持。