丹参DHN1基因的克隆与序列分析

丹参(Salvia miltiorrhiza Bge．)是一种重要的药用植物。以组织培养2～13w的丹参幼苗为材料,构建丹参cDNA库并进行大规模EST序列分析,所得序列经NCBI的BLAST工具分析,克隆号为rsmsxl-009377的序列与晚期胚胎丰富(Late Embryogenesis Abundant)基因家族Ⅱ中的成员有较高的同源性。根据其5’单向测序的结果设计引物“5'-GTGCGTAGACACATCGGTTC-3'”继续向3’测序,得到一个全长969bp的序列,序列分析发现该序列包含一个长690bp的开放阅读框(ORF),编码229个氨基酸,与NCBI注册的脱水素家族基因具有较高的同源性,且含有ⅡLEA蛋白的特征序列,表明本基因可能是一种新的脱水素基因,命名为DHN1,并住GENEBANK上进行了注册,序列号为：AY695932。     

丹参晚期胚胎富集蛋白基因SmLEA的表达特征研究

利用DNA walking的方法克隆到了丹参SmLEA基因 5′ 端上游调控序列,约1 038bp。经生物信息学预测分析,该区域含有多种与逆境胁迫、ABA、种子特异表达相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR检测结果表明,100 μmol/L ABA,200mmol/L NaCl,低温（4℃）及脱水处理后,SmLEA基因的表达均得到了明显的提高,与启动子序列分析的结果相符合。表明SmLEA基因可对盐、脱水和低温胁迫以及 ABA做出响应。     

丹参病程相关蛋白基因PR10的克隆与表达分析

病程相关蛋白(PR)的产生与积累是植物体应对生物或非生物胁迫的主要特征之一。该研究以人工培养的丹参幼苗为材料,通过分析丹参转录组数据,根据丹参病程相关蛋白基因PR10的序列设计特异性引物,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从丹参中获得PR10基因的开放阅读框(ORF),命名为SmPR10-1(GenBank注册号KF877034),并进行原核表达和纯化。结果表明:(1)SmPR10-1基因ORF为477bp,编码158个氨基酸,其蛋白质分子质量为17.38kD。(2)通过蛋白结构预测、序列多重比对和构建进化树等生物信息学分析,发现SmPR10-1基因具有保守序列(G-X-G-G-X-G)和(K-A-X-E-X-Y),其编码蛋白与葡萄等双子叶植物中的PR10蛋白同源性较高。(3)经异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,含有表达载体pET32a-SmPR10-1的大肠杆菌(Escherichia coli BL21)可诱导表达融合蛋白;对影响蛋白表达的4个因素优化结果表明,SmPR10-1蛋白的最佳表达条件为:IPTG终浓度0.4mmol/L、起始宿主菌密度A600为0.8、诱导温度30℃、诱导时间8h,并得到纯化的SmPR10-1蛋白。该结果为进一步研究SmPR10-1基因在丹参抗病方面的生物学功能和培育丹参抗病品种奠定了基础。     

转柽柳晚期胚胎富集蛋白基因烟草T1代的耐盐性评价

目的:验证转柽柳晚期胚胎富集(LEA)蛋白基因烟草T1代的耐盐性。方法:采用盐胁迫方式,对转柽柳LEA蛋白基因烟草T1代的6个株系及非转基因对照烟草T1代进行不同浓度NaCl胁迫处理,分析了NaCl胁迫下转基因烟草的生长量、根系的发育及盐害程度。结果:各转基因烟草T1代组培苗在150mmol/L的NaCl培养基上根系生长良好,平均增重(鲜重)是非转基因对照的7.72倍,平均高生长是非转基因对照的3.51倍,盐害指数低于或等于50%;而非转基因对照烟草T1代组培苗生长缓慢,根系几乎不能生长发育,盐害指数达65%。结论:柽柳LEA蛋白基因的导入提高了T1代烟草的耐盐性。     

丹参硫氧还蛋白基因SmTrxh的克隆和生物信息学分析

对丹参EST数据库进行BLAST同源性比对发现,登录号为CV165156的EST序列与硫氧还蛋白基因（Trx）有很高的同源性。进一步用PCR方法从丹参基因组水平上克隆到长1806bp的DNA序列（登录号为FJ217699）,与cDNA序列比对发现,该基因（SmTrxh）含有2个内含子。生物信息学分析表明,SmTrxh所编码蛋白的分子质量为13．4kDa,理论等电点为5．53,无信号肽,属于定位于细胞质中的稳定类蛋白。该蛋白与其他7种植物中的Trx高度同源,同源性介于68％-74％之间。实时定量PCR检测的结果显示,SmTrxh在丹参中为组成型表达基因,在根、茎和叶中都有表达,主要在根部表达,茎中的表达量最低。     

丹参肉桂醇脱氢酶基因（SmCAD）的克隆及表达分析

肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD）依赖于NADPH还原肉桂醛及其衍生物,是催化木质素单体生物合成途径的最后一步关键酶。通过分析丹参转录组数据库,从丹参中获得一条肉桂醇脱氢酶基因,命名为SmCAD（Genebank注册号：HQ162287）。该序列包含一个长为1083 bp的开放阅读框,有3个内含子和4个外显子,编码360个氨基酸,含有NADP（H）结合域,Zn1和Zn2锌结合位点。利用BD walking的方法获得其启动子序列1202 bp,序列分析结果表明,SmCAD启动子区包含茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA3）响应元件以及MYB结合位点。利用实时荧光定量PCR分析表明,该基因在丹参根、茎、叶中均有表达,且其表达受到MeJA的诱导和GA3的抑制,推测该基因可能参与了丹参对外源信号的应答反应。研究结果可为进一步研究SmCAD基因在丹参中的具体功能提供理论依据。     

丹参非特异性脂质转移蛋白基因（SmLTP1）的克隆及其表达分析

对丹参EST序列进行Blast分析,获得一个新的非特异性脂质转移蛋白基因,命名为SmLTP1（GenBank注册号为EF187461）。该基因cDNA全长593bp,包含一个长为357bp的开放读码框,编码118个氨基酸。生物信息学结构分析表明,该蛋白具有植物nsLTP的典型结构,即4对二硫键,4个a-螺旋,1个可结合和容纳脂肪酸分子的类似口袋状的疏水结构。实时荧光定量PCR分析结果表明,SmLTP1基因在丹参不同组织器官中差异表达,其表达受病原菌和茉莉酸甲酯的诱导,显示SmLTP1基因在植物防御反应中发挥作用。     

玉米胚胎发生后期丰富蛋白基因的启动子克隆与功能验证

该研究在生物信息学分析的基础上,克隆玉米胚胎发生后期丰富蛋白基因(MGL3)的启动子序列(pMGL3),进行非生物逆境应答元件分析以及实时定量PCR验证其非生物逆境胁迫响应特性,构建了pMGL3启动子驱动报告基因(GUS)表达载体,基因枪法转化玉米愈伤组织,通过GUS染色验证pMGL3启动子在非生物逆境胁迫下的驱动活性。再根据启动子序列分析结果,去除不同的顺式作用元件,构建不同长度pMGL3启动子驱动报告基因GUS表达载体,农杆菌介导法转化烟草叶盘,以确定pMGL3启动子的最短活性序列。结果显示:pMGL3启动子长1 554bp,存在多种与非生物逆境胁迫应答相关的调控元件,在干旱、高盐、低温胁迫及脱落酸、乙烯诱导下驱动MGL3基因增量表达,用以驱动GUS基因转化玉米愈伤组织,在高渗、高盐、低温胁迫及脱落酸诱导下具有驱动活性,且截短至325bp仍可保持驱动活性。研究表明,pMGL3启动子的确有非生物逆境诱导启动活性,进一步验证其作用机理后可运用于玉米抗逆转基因研究。     

丹参胁迫诱导基因SmSIP1的表达特征分析

从丹参EST库中筛选到一个胁迫诱导蛋白基因,命名为SmS1P1,其序列全长296bp,编码80个氨基酸。生物信息学预测表明SmS1P1是一个亲水的,不具有跨膜结构域,包含一个N-端信号肽和多个可能的磷酸化位点的蛋白。实时荧光定量PCR分析显示,SmS1P1在根中的表达量高于茎和叶,并且受ABA和干旱的诱导,推测其可能参与根部的胁迫应答反应。     

丹参肉桂酰辅酶A还原酶基因克隆与生物信息学分析

分析丹参转录组数据库,获得一条新的肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoA reductase,CCR)基因,命名为SmCCR-2(GenBank注册号为JF784010)。该基因包含一个长为966 bp的完整开放读码框,编码321个氨基酸残基。生物信息学分析显示,SmCCR-2编码的蛋白具有NWYCY基序,属于NABD_Rossmann超家族,相对分子量为35.80 kD;预测SmCCR-2为中性亲水的稳定蛋白,存在跨膜结构域。实时荧光定量PCR结果表明,SmCCR-2基因在丹参各组织都有表达,茎中表达量最高。其表达受到病原菌的影响,表明SmCCR-2基因可能与植物防御反应有关。     

丹参SmGGPPS3基因的克隆及表达分析

香叶基香叶基焦磷酸合酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)是植物细胞二萜类物质合成的重要调节靶点。本研究从药用植物丹参中克隆了一条新的GGPPS基因(SmGGPPS3),基因全长2908 bp,包含一个931 bp的内含子和一个960 bp的编码序列。推测的氨基酸序列与蓖麻、橡胶、拟南芥等植物GGPPS一致性达到67%以上。实时定量PCR结果显示,SmGGPPS3基因在丹参不同发育时期不同器官中表达差异显著,同时受茉莉酸甲酯和病原菌的诱导。遗传互补实验也表明,SmGGPPS3编码蛋白具有GGPP合酶的活性。     

丹参bHLH转录因子基因SmMYC2的克隆和表达分析

MYC2是植物茉莉酸类激素响应途径中的核心转录因子,在植物防御反应、次生代谢调控及生长发育过程中均有重要的调控作用。基于丹参转录组和基因组survey序列,本研究克隆了丹参转录因子MYC2的基因序列,并命名为Sm MYC2(Gen Bank No.KJ945636)。Sm MYC2基因的c DNA序列长度为1910 bp,开放阅读框(ORF)的长度为1809 bp,编码602个氨基酸,无内含子;该基因编码蛋白与烟草、番茄等植物的MYC2蛋白具有较高的同源性;Sm MYC2蛋白无跨膜结构域、信号肽等结构。实时荧光定量PCR检测结果显示,Sm MYC2在丹参的根、茎、叶、花中均有表达,并且在根和茎中的表达量更高;此外,该基因表达受茉莉酸甲酯、光和机械损伤的诱导,但受赤霉素的抑制。本实验结果为进一步探讨Sm MYC2基因在丹参中的生物学功能奠定了基础。     

丹参miR408基因前体序列的克隆及表达分析

MiR408是植物中一类高度保守的miRNA,其靶基因编码含铜蛋白,miR408的表达受植物生长发育和环境条件的显著影响。拟南芥中miR408在HY5-SPL7基因网络中起着关键作用,而HY5-SPL7基因网络可介导拟南芥对光照和铜离子的协调应答,进一步表明miR408在植物对环境的响应中发挥了核心作用。本研究基于丹参基因组Survey数据库,从中搜索并克隆得到366 bp的含有稳定茎环结构的miR408前体序列及其上游723 bp片段的启动子区,Gen Bank登录号分别为KU360384和KU360385,并将miR408的前体序列命名为SmMIR408。生物信息学分析结果显示:Sm-MIR408上游启动子序列与模式植物拟南芥Ath-MIR408、水稻OsaMIR408启动子区具有许多相同的顺式作用元件,如G-box、CGTCA-motif、TGACG-motif、GTAC-motif等,而HSE、CATT-motif作用元件仅存在于丹参启动子区;miR408成熟序列在不同物种中具有很高的保守性;基于不同物种miR408前体序列构建的系统进化树显示,来源于单子叶植物的miR408前体序列聚为一支,来源于双子叶植物的miR408前体序列聚为另一支。实时定量PCR分析结果显示:Sm-MIR408在丹参的根、茎、叶、花中都有表达,其在花中的表达量最高,根中最低;Sm-MIR408的表达受茉莉酸甲酯和伤害的抑制,黑暗和持续光照也可抑制该基因的表达。Sm-MIR408基因的克隆与表达分析为今后研究丹参miR408的功能奠定了基础。