Die Phenoloxydasen des Ascomyceten Podospora anserina

Summary Laccase of the wild strain of Podospora anserina was purified by subsequent treatment with protamine sulfate, precipitation with ammonium sulfate and column chromatography on DEAE-Sephadex and hydroxylapatite. The purity was confirmed by sedimentation and electrophoresis (molecular weight about 361 000, isoeletric point at pH 5.1).The blue-coloured pure laccase has its absorption-maxima at 280 and 605 m. The substrate specifity of the enzyme corresponds to results which have been earlier obtained with unpurified preparations (Esser 1963 b). Laccase is very temperature sensitive. It loses its activity after both freezing and heat treatment (half-life time at 60°C about 6 min). The Michaelis-constants as determined with Dopa, potassium ferrocyanide and catechol are in the range of 2 to 5·10^-3 Mol/l. The appropriate value for ascorbic acid is about 10^-2 less. The laccase contains about 12% carbohydrate and about 7,5% nitrogen. According to its copper content of 0.123% the laccase carries seven atoms of copper per molecule.

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Teil I erschien in Arch. Mikrobiol. 46, 217–226 (1963).     

Aminopeptidasen des Ascomyceten Podospora anserina

Zusammenfassung Aus dem Wildstamm des Ascomyceten Podospora anserina wurden zwei Aminopeptidasen isoliert, die immunologisch nicht verwandt sind: P1 hat ein MG von ung. 140000, sie kann durch Hitzebehandlung aktiviert werden (z. B. 8 min bei 80° C um 100%) und wird von DFP (5 mM) vollständig gehemmt. Wie Hydrolyseversuche mit über 30 Oligopeptiden zeigten, hat sie eine ziemlich enge Substratspezifität (z. B. für Ala-Pro, Gly-Pro-Ala, Glu-Gly-Phe und Valinpeptide). P1 wird durch Behandlung mit 0,1% SDS nicht in Untereinheiten gespalten.P2, eine typische (Leucin) aminopeptidase, hat ein MG von etwa 70000, sie wird durch Hitze nicht aktiviert und durch DFP kaum gehemmt. P2 ist sehr unspezifisch und hydrolysiert alle getesteten Oligopeptide, wie z. B. Di- und Triglycin, Pro-, Asp-, Glu- und Trp-Peptide, die oxydierten Insulin-A- und (z. T.)-B-Ketten, jedoch nicht das native Protein. P2 wird durch 0,1% SDS in inaktive Untereinheiten (MG um 15000) gespalten, die reaggregieren können, wobei aktive Proteine von etwa 35000 bzw. 150000 entstehen, jedoch keine P2 (70000) mehr. Daraus und aus Untersuchungen mit der Immundiskelektrophorese wird geschlossen, daß die (Leucin)aminopeptidase P2 von P. anserina aus Untereinheiten besteht, die abhängig von noch unbekannten Bedingungen mehr oder weniger aggregiert vorliegen können.Dies wird auch durch die Verhältnisse bei der rhythmischen Mutante zonata bestätigt: Hier konnte P1 nicht nachgewiesen werden, dagegen wurde ein Enzym (Pz) isoliert, das serologisch mit P2 verwandt ist, in verdünnter Lösung jedoch ein MG von 35000 aufwies. Pz bildet in der Diskelektrophorese eine sehr breite Bande, der K _m -Wert des Enzyms (um 10^-3) für Leu-4-NA liegt um das 10fache höher als beim Wildenzym.Morphologische und cytochemische Ähnlichkeiten zwischen zonata und solchem wild-Mycel, in dem eine heterogenische (vegetative) Inkompatibilitätsreaktion abläuft (z. B. anomaler Wuchs, freie AP-Aktivität im Cytoplasma), werden diskutiert.

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Aminopeptidases from the ascomycete Podospora anserina Genetical differences between the wild strain and the mutant zonata

Summary Two immunologically unrelated aminopeptidases (P1 and P2) from the wild strain of the Ascomycete Podospora anserina were isolated and characterized. P1 has a molecular weight (MW) of about 140000, it can be activated by heat treatment (e. g. 8 min/80° C=100%) and is completely inhibited by DFP (5 mM). The enzyme specificity was tested with more than 30 oligopeptides as substrates, However, few of them were attacked significantly (Ala-Pro, Gly-Pro-Ala, Glu-Gly-Phe and two valine peptides). P1 is not cleaved into subunits by treatment with 0.1% SDS, but serological tests indicate the existence of a dimer in crude mycelial extracts.P2 (a typical leucine aminopeptidase) has a MW of about 70000. There is no heat activation and no inhibition by DFP. It has a large substrate range, hydrolyzing all oligopeptides tested, including di- and triglycine, pro-, asp-, glu-, and trp-peptides. Oxydized A- and B-chains of insuline are also partly digested but not the native protein. P2 is cleaved by 0.1% SDS into inactive subunits (MW about 15000) which may be reaggregated yielding active proteins with MWs of approximately 35000 and 150000 but no aggregates of the original MW of 70000.From these facts and from immunoelectrophoretical investigations it is concluded that the (leucine) aminopeptidase P2 is composed of subunits, which appear more or less aggregated, depending on conditions still unknown.This is corroborated by analyses of the clock mutant zonata: In this strain P1 could not be detected. An enzyme (Pz) was isolated which is serologically related to P2 but has a molecular weight of only 35000. Pz yields a broad band in disc electrophoresis and its K _m -value is tenfold increased as compared with the wildtype enzyme.Morphological and cytochemical similarities between the mutant zonata and wildtype mycelia displaying the action of heterogenic (vegetative) incompatibility (e. g. abnormal growth, free AP-activity in the cytoplasm) are discussed.

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Abkürzungen AP Aminopeptidase - DE Diskelektrophorese - DFP Diisopropylfluorphosphat - IEF Isoelektrische Fokussierung - Hb Hämoglobin - Leu-4-NA Leucin-4-nitroanilid - Leu--NA Leucin--naphthylamid - MG Molekulargewicht - RSA Rinderserumalbumin - SDS Natriumdodecylsulfat Mit Unterstützung der Deutschen Forschungsgemeinschaft und des Landesamtes für Forschung (NRW).     

Die Phenoloxydasen des AscomycetenPodospora anserina

Zusammenfassung Die Tyrosinase der Mutantezonata (z) vonPodospora anserina wurde untersucht. Die Mutante erzeugt im Vergleich zum Wildstamm große Mengen Tyrosinase.z ist eine morphologische Mutante mit rhythmischen Wuchs. Das Genz liegt auf dem rechten Arm der Koppelungsgruppe II und hat einen Abstand von 46 Kartierungseinheiten vom Centromer.Die Reinigung des Enzyms erfolgte durch Präzipitation mit Protaminsulfat, Ammoniumsulfat und anschließende Säulenchromatographie an DEAE-Sephadex und Hydroxylapatit. Die Einheitlichkeit des gereinigten Enzyms wurde in der Ultrazentrifuge und der Elektrophorese festgestellt. Das gereinigte Enzym ist in verdünnter Lösung instabil.Im Konzentrationsbereich von 2–15 mg/ml hat die Tyrosinase eine Sedimentationskonstante vons _20,w ⁰ =6,04. Die Molekulargewichtsbestimmung aus Diffusion und Sedimentation und aus dem Sedimentationsgleichgewicht nachYphantis ergab in demselben Konzentrationsbereich ein Molekulargewicht um 100.000. Bei einer Enzymkonzentration von 0,04 mg/ml fanden wir mit der Gelfiltrations-methode nur ein Molekulargewicht von 42.000. Aus diesen Resultaten läßt sich in Übereinstimmung mit den Ergebnissen an anderen Tyrosinasen aus Pilzen eine konzentrationsabhängige Assoziation und Dissoziation des Enzyms folgern.Der Kupfergehalt beträgt 0,214±0,008%. Das gereinigte Enzym hat ein Absorptionsmaximum bei 280 nm und eine Schulter bei 290 nm und von 320 bis 380 nm.Das Verhältnis von Dehydrogenierungen an Brenzcatechin zu Hydroxylierungen an Hydrochinon konnte polarographisch bestimmt werden. Es läuft im Mittel auf zwei Dehydrogenierungen nur eine Hydroxylierung ab. Natriumazid wirkt als reversibler und kompetitiver Inhibitor der Dehydrogenierungsreaktion.Im Rohextrakt liegt das Enzym in einer latenten Form vor. Es sind nur 10–20% der späteren Aktivität nachzuweisen. Das Enzym wird im Verlauf der Reinigungsprozedur oder durch Temperaturbehandlung (10 min bei 60°C) aktiviert. Der Aktivierungsvorgang ist von einer Veränderung der elektrophoretischen Beweglichkeit des Enzyms begleitet. Latentes und aktives Enzym unterscheiden sich nicht in ihrem Sedimentationsverhalten.

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The phenoloxidases of the ascomycetePodospora anserina IV. Purification and properties of tyrosinase

Summary Tyrosinase of the mutantzonata (z) ofPodospora anserina was investigated. In comparison to the wild strain the mutant (z) produces large quantities of tyrosinase.z is a morphological mutant with rhythmic growth. The genez is localized on the right arm of linkage group II at a distance of 46 map-units from the centromere.The enzyme was purified by precipitation with protamine-sulphate and ammonium sulphate and by subsequent column-chromatography on DEAE-Sephadex and hydroxylapatite. The homogeneity of the purified enzyme was checked by ultracentrifugation and disc-electrophoresis. The purified enzyme is unstable in dilute solution.At a concentration of 2–15 mg/ml the tyrosinase has a sedimentation constant ofs _20,w ⁰ =6.04. The determination of molecular weight from sedimentation and diffusion constants and from sedimentation-equilibrium according toYphantis showed a molecular weight of approximately 100,000 in the same concentration range. At an enzyme concentration of 0.04 mg/ml we found a molecular weight of only 42,000 using the gel-filtration technique. From these results, in accordance with the results obtained from other tyrosinases in fungi, association and dissociation of the enzyme dependent on concentration may be concluded.The copper content reaches a level of 0.214±0.008%. The purified enzyme has an absorption maximum at 280 nm and a shoulder at 290 nm and from 320 to 380 nm.The quotient of catechol-dehydrogenations to hydroquinone-hydroxylation was determined polarographically. The mean ratio is two dehydrogenations to only one hydroxylation. Sodium azide acts as a reversible and competitive inhibitor of the dehydrogenation-reaction.In the crude extract the enzyme is found in a latent form. Only 10–20% of its later activity can be demonstrated. The enzyme is activated in the course of the purification procedure or by temperature treatment (10 min at 60°C). The activation process is accompanied by a change in the electrophoretic mobility of the enzyme. Latent enzyme and active enzyme do not differ in their sedimentation behaviour.

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Mit Unterstützung der Deutschen Forschungsgemeinschaft     

Die Phenoloxydasen des AscomycetenPodospora anserina

Ohne ZusammenfassungProfessorG. Melchers zum 60. Geburtstag.     

Rhythmisches Mycelwachstum bei Podospora anserina

The correlation between membrane structure and morphogenesis in fungi was examined by studying the effect of surface-active and membrane-altering substances upon the colonial shape of Podospora anserina. The following results were obtained:

1. The alcohols 1-propanol, 1-butanol and 1-octanol inhibited hyphal elongation and thus caused zonations in the wild strain. In the clock-mutant zonata, however, the zonations disappeared at high concentrations of the alcohols.
2. The detergents sodium-dodecylsulfate, sodium-desoxycholate, triton X-100 and brij-35 also induced zonations, i.e. rhythmic growth. Growing on complete media, the sensibility of the strains used was markedly reduced.
3. The antibiotics nonactin, nigericin and monensin, too, inhibited growth and caused zonations, which, however, were light dependent. In contrast, valinomycin inhibited the elongation of the hyphae only.

The results are discussed as consequences of alterations in structure and features of the membranes.     

Mutations affecting meiosis in Podospora anserina

Forty mutants affecting meiosis and two affecting caryogamy were isolated in Podospora anserina. Growth and mitosis of these mutants were normal. Eighteen of them were studied by both light and electron microscopy so as to determine precisely how the behaviour of the chromosomes and/or the structure of the kinetic apparatus were altered.In the caryogamy-deficient mutants, the formation of crosiers is normal, but the nuclei of the apical cells never fuse. Three genes affect prophase I. For two of them the mutants are blocked before pachytene, the third being blocked between pachytene and diplotene. The other mutations concern the kinetic apparatus (centrosomal plaques, spindle) and the distribution of the nuclei in the spores.Some of these mutations are pleiotropic and also affect spore pigmentation, recombination frequency, and mutation rate.