节节麦-黑麦双二倍体α醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

以人工合成节节麦-黑麦双二倍体基因组DNA为模板,用小麦种子醇溶蛋白保守引物进行PCR扩增,经克隆测序获得了843~897 bp共15个新的DNA序列(GenBank登录号为: JQ029719,JQ046392~JQ046405),分别编码280~298个氨基酸。序列比对结果表明,它们具有α-醇溶蛋白基因的典型结构特点,是α-醇溶蛋白基因家系成员,其中有两个序列为同义突变。利用14个新氨基酸序列与乳糜泻(celiac disease)病人毒性抗原相关序列的比对,发现有8个序列的Glia-α-2和Glia-α-9型抗原序列产生缺失和替换。与来自粗山羊草属和黑麦属的α-醇溶蛋白基因的编码氨基酸建立系统树,结果表明,14个DNA序列编码的氨基酸序列与粗山羊草属的相关序列聚在一起。     

小麦抗虫α-淀粉酶抑制因子成熟蛋白编码基因序列分析

对17份小麦和山羊草材料的小麦抗虫24kD-α-淀粉酶抑制因子成熟蛋白编码基因进行了分离克隆和序列分析。结果发现,在二倍体材料中α-淀粉酶抑制因子由单个基因编码,而在普通小麦中是以多拷贝的形式存在。从中得到17个24kD-α-淀粉酶抑制因子基因,其中2个来自普通小麦与1个来自粗山羊草的基因编码的抑制因子与WDAI-0-19的氨基酸序列完全相同,为同一蛋白。在普通小麦中得到1个编码蛋白质与WDAI-0-53十分相似的基因。序列分析表明,24kD-α-淀粉酶抑制因子成熟蛋白编码基因在序列大小与核酸组成上都十分相似,一致性达到91.2%。这说明小麦和山羊草中24kD-α-淀粉酶抑制因子基因可能起源于相同原始基因。     

西藏青稞4个B组醇溶蛋白基因的克隆和特征

从两份西藏青稞材料中分离克隆出4个B组醇溶蛋白基因（BH1—BH4）,DNA测序结果表明：它们均包含完整的开放阅读框。推断的氨基酸序列与先前报道的大麦B组醇溶蛋白具有相同的蛋白质基本结构。系统分析表明：它们推断的氨基酸序列与栽培大麦中的B组醇溶蛋白具有较高的相关性,与野生大麦和山羊草属的醇溶谷蛋白相似性较低。并且,在4个基因BH1—BH4中,BH1与先前报道的B组醇溶蛋白基因有较低的序列相似性,因此我们对BH1基因进行了原核表达,含该基因的表达载体在大肠杆菌中表达出相对分子质量为28．15kDa并以包涵体形式存在的蛋白,进一步对其在青稞谷粒品质改良中的潜在价值进行了探讨。     

节节麦-黑麦双二倍体种子贮藏蛋白的变异分析

利用SDS-PAGE和A-PAGE方法对获得的遗传稳定性逐年提高节节麦-黑麦双二倍体的麦谷蛋白和麦醇溶蛋白进行了分析.结果显示:在高分子量谷蛋白区域,双二倍体共检测到3条带,其中第1和第3条带与亲本节节麦的5t和10t亚基大小一致,中间的第2条带是两亲本都未出现的新麦谷蛋白条带,而黑麦的2r和6.5r亚基在双二倍体材料中未检测到;在低分子量谷蛋白区域,黑麦和节节麦分别有4条和2条带在双二倍体材料中未检测到.在醇溶蛋白的γ和β区,黑麦共有5条带在双二倍体材料中未检测到,在ω区,节节麦有1条带未检测到.研究表明,在双二倍体中两亲本控制贮藏蛋白的基因组之间发生了较大的改变,与亲本节节麦相比较,亲本黑麦控制的贮藏蛋白发生的改变更大;两亲本控制贮藏蛋白基因的遗传方式在双二倍体材料中表现为非加性效应.     

羊草光合作用相关基因的克隆与分析

在构建了羊草叶片cDNA文库的基础上,利用M13载体通用引物筛选其亚文库,挑选阳性克隆进行测序,将测序结果在NCBI基因库中进行比对,得到一个Rubisco大亚基基因全长序列和Rubisco小亚基基因部分序列,并对其核苷酸及其编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,Rubisco大亚基基因长度为1 796 bp,与禾本科大麦、小麦、野雀麦、粗山羊草、旱麦草、异形花草、黑麦等的核苷酸序列同源性达98%以上;羊草的Rubisco小亚基基因部分序列含有一个开放阅读框,其长度为186 bp,编码61个氨基酸,与禾本科的小麦、大麦、燕麦、黑麦以及扁穗雀麦Rubisco小亚基基因氨基酸序列的同源性分别为93%、93%、91%、91%、92%。羊草Rubisco基因的克隆与分析有利于进一步研究其光合作用效率。     

茶陵野生稻冷响应基因OrCrZFl的克隆与生物信息学分析

OrCrZFl基因是基于水稻基因表达芯片分析从茶陵野生稻中筛选出的一个受低温诱导、编码类锌指蛋白的基因。以茶陵野生稻为材料,用RT-PCR方法扩增获得了包含其完整ORF的cDNA克隆。根据其ORF进行预测,该基因编码一个包含492个氨基酸残基的蛋白,其理论分子量为51.895 kD,pI=6.21。经蛋白质相似性比对,其编码蛋白与日本晴第8号染色体上Os08g0536300基因编码的蛋白质(GenBank登录号:XP_015649825.1,zinc finger protein CONSTANS-LIKE 14)氨基酸序列一致性为98.37%;其第145位到第492位氨基酸序列与籼稻93-11的预测蛋白(EEC83950.1, hypothetical protein OsI_30045)一致性为96.55%;其第16位到第492位氨基酸序列与谷子(Setaria italica)、高粱(Sorghum bicolor)、玉米(Zea mays)、粗山羊草(Aegilops tauschii subsp.tauschii)及穿心莲(Panicum hallii)编码的蛋白(zinc finger protein CONSTANS-LIKE 14/15)一致性为67.35%～72.47%。对其可能的启动子区域序列分析,发现多个可能与逆境或逆境激素反应有关的顺式作用元件。基于以上结果,我们认为该基因为一新的野生稻耐冷候选基因。     

一个小麦ω-醇溶蛋白基因同源序列的分离与序列分析

通过基因组PCR克隆了小麦济南177的一个ω-醇溶蛋白基因同源序列（ω1236）,该序列包括部分5′、3′ 侧翼序列和全部可能的编码序列,没有内含子,但在第87、117、125、160、198、313、357和365氨基酸残基处有终止密码子,所有8个终止密码的形成都是碱基转换的结果。比较分析发现,该序列与一个ω-醇溶蛋白基因序列（AB059812）有98%的同源性。推导的氨基酸序列表明该基因符合禾谷类醇溶蛋白的特点。系统进化分析表明,该序列与小麦ω醇溶蛋白在进化上亲缘关系较近,与α-,β-,γ-醇溶蛋白基因关系较远。ω1236推导的氨基酸序列编码了一个可能的47.2 kDa的蛋白质。转化大肠杆菌发现,在IPTG诱导后最初2 h,有小肽段产生,这说明在该基因序列中可能存在终止密码,这与测序结果是一致的。该研究为用PCR技术克隆ω醇溶蛋白基因和进一步研究ω醇溶蛋白基因的结构和功能积累了资料。     

小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性与α2-微管蛋白序列无关析

[目的]研究小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性与α2-微管蛋白基因的相关性.[方法]比较对多菌灵不同敏感性水平菌株间在药剂作用下的形态学特征及其α2-微管蛋白基因异同.[结果]当敏感菌株和田间中抗菌株均在各自EC50和EC90浓度作用下,两者分生孢子芽管和初生菌丝均表现畸形,肿胀,分支增多.根据小麦赤霉病菌核基因组测序菌株NRRL31 084(PH-1)的α2-微管蛋白基因核苷酸序列设计4对引物,采用PCR方法克隆并测定了小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)对多菌灵(MBC)不同敏感性表型的8个中国菌株的α2-微管蛋白基因全序列.DNA序列比对结果表明中国的4个敏感菌株和4个抗药性菌株的α2-微管蛋白基因核苷酸序列同源性没有差异,多菌灵抗药性与α2-微管蛋白无关.该基因全长1712 bp,含有4个内元,编码453 aa;与NRRL31 084的α2-微管蛋白基因核苷酸序列同源性为99%,存在5个差异核苷酸,与其所编码的氨基酸序列同源性为100%;与其他9种真菌α2-微管蛋白基因所编码的氨基酸序列同源性为64%～89%.[结论]小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性与α2-微管蛋白序列无关.     

粗山羊草(Aegilops tauschii)中Pinb基因的克隆和表达分析

puroindoline a(Pina)和puroindoline b(Pinb)是控制小麦籽粒硬度的主效基因。根据已报道的小麦Pinb基因的保守序列,设计合成了一对特异性引物,对粗山羊草Aegilops tauschii(DD)的基因组DNA进行Pinb基因扩增、克隆和序列分析,发现了一个新型Pinb等位基因。该基因长447 bp,编码148个氨基酸残基,具有麦类作物PinB蛋白所特有的WPTKWWK色氨酸结构域和10个半胱氨酸所形成的5个二硫键结构。与软粒小麦cv.Capitole的Pinb-D1a相比较,该基因含有14个氨基酸变异位点,其中包括一个紧邻色氨酸结构域的变异位点(Val66Phe),其核苷酸和氨基酸同源性分别为93.3%和90.5%。RT-PCR和Western Blot证实了Pinb基因在籽粒胚乳中的表达。Southern Blot分析结果表明,粗山羊草中Pinb基因为单拷贝。研究结果表明,粗山羊草中包含着与小麦差异较大的籽粒硬度控制基因,对此基因的进一步研究将加深对小麦籽粒硬度形成分子机制的了解。     

禾谷镰孢菌α-微管蛋白基因克隆及其与多菌灵抗药性关系分析

根据禾谷镰孢菌参考菌株NRRL310 84 (PH 1)的α- 微管蛋白基因核苷酸序列设计 4对引物 ,采用PCR方法克隆并测序了禾谷镰孢菌 (Fusariumgraminearum)对多菌灵 (MBC)不同敏感性表型的 6个中国菌株的α 微管蛋白基因全序列。DNA序列对照表明中国的 3个敏感菌株和 3个抗药菌株的α- 微管蛋白基因核苷酸序列同源性没有差异 ,多菌灵抗药性与α- 微管蛋白无关。该基因全长 1718bp ,含有 6个内元 ,编码 4 4 9aa ;与NRRL310 84的α- 微管蛋白基因核苷酸序列同源性为 99% ,存在 5个差异核苷酸 ,与其所编码的氨基酸序列同源性为 99 78% ;与其他 6种真菌α- 微管蛋白基因所编码的氨基酸序列同源性为 37%～ 86 %。     

簇毛麦(Dasypyrum villosum L.)中一个γ-醇溶蛋白基因序列的研究

目的：研究簇毛麦中一个新的γ-醇溶蛋白基因序列及结构特点,为小麦品质育种和该类基因的进化分析提供资料。方法：利用基因组PCR技术从簇毛麦基因组中克隆到1个γ-醇溶蛋白基因（Dv-γ）的全编码序列,利用生物信息学研究其序列结构特点。结果：该序列与已知的γ-醇溶蛋白有着很高的相似性。推导的氨基酸序列包含5个典型的结构域,其中含有8个保守半胱氨酸残基,高变重复区Ⅱ中的重复单元与其他物种来源基因有较大区别。γ-醇溶蛋白中常见的乳糜泄抗原决定簇在其内部也有发现。进化分析表明,此基因与亚家族Ⅰ中的γ-醇溶蛋白基因有着较近的亲缘关系。结论：获得了一个新的γ-醇溶蛋白基因。     

香蕉束顶病毒NS株DNA组分5的克隆和序列分析

本文利用PCR技术扩增得到香蕉束顶病毒(BBTV)NS株DNA组分5的全基因,该基因全长为1014nt,具有一个开放阅读框,编码146个氨基酸,蛋白质二级结构包括6个α-螺旋,7个β-折叠.NS株系与南太平洋组澳大利亚、夏威夷、埃及分离物DNA组分5核苷酸和编码的氨基酸序列相比较,核苷酸序列同源率介于88%～89%之间,氨基酸序列同源率介于80%～88%之间.NS株系与其它分离物在编码成视网膜细胞瘤蛋白(Retinoblastoma protein,Rb)的基元序列"LXCDE"附近的二级结构上表现明显的差异,推测这种差异可能影响与植物中Rb蛋白的结合效率.     

黑麦属种间叶绿体DNA的变异性和种系发生的关系

为了获得有关黑麦属种间关系、黑麦属与小麦属和山羊草属种系发牛关系的新资料,应用Ban HI等8种限制性核酸内切酶酶解黑麦属5个种的叶绿体DNA,进行琼脂糖凝胶电泳,分析其酶解图谱。结果表明,黑麦属种叶绿体基因组的大小与小麦属和山羊草属的叶绿体基因组非常相似。根据黑麦属5个种遗传距离的估算,并与小麦属和山羊草属已知叶绿体基因组间所观察到的遗传距离相比,黑麦属叶绿体基因组的分化很少;这些资料进一步证实黑麦属的近代起源;并表明黑麦属、小麦属和山羊草属间的亲缘关系是非常密切的。     

节节草化学成分的研究

应用柱层析、薄层层析及重结晶等方法,从木贼科问荆属植物节节草（Equisetum ramosissimum）的全草中分离得到17个化合物,经现代波谱技术鉴定了它们的结构,分别为：5α,6α-环氧-β-紫罗兰酮-3-O-β-D-葡萄糖甙（1）、loliolide（2）、环阿尔屯烷～24（30）-烯-3β-醇（3）、环阿尔屯烷-22（23）-烯-3β醇（4）、麦角甾-6,22-二烯-3β,5α,8α-三醇（5）、木栓醇（6）、芹菜素（7）、芫花素（8）、芫花素-5-O-β-D-葡萄糖甙（9）、芹菜素-5-O-β-D-葡萄糖甙（10）、木犀草素（11）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖甙（12）、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖甙（13）、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-葡萄糖甙（14）、腺嘌呤核苷（15）、β-谷甾醇（16）和β-胡萝卜甙（17）。其中化合物1～5、15为首次从该属植物中分离得到。     

柞蚕14-3-3基因的鉴定及表达分析

14-3-3蛋白是一种可以改变其结合蛋白构象的酸性蛋白质.柞蚕14-3-3 cDNA序列全长1 220 bp,包括一个126 bp的5'非编码区和一个350 bp的3'非编码区.该基因的开放读码框长度为744 bp,编码247个氨基酸.序列比对结果表明,柞蚕14-3-3蛋白与家蚕的14-3-3蛋白具有高度同源性.此外对柞蚕14-3-3基因进行了原核表达和重组蛋白纯化.SDS-PAGE和免疫印迹结果表明,分子量大小约32 kD的重组蛋白在大肠杆菌中得到了成功表达.     

小麦拔节过程中基部茎节的基因差异表达

采用差异显示逆转录PCR(DD-RT-PCR)技术分析小麦基部茎节伸长过程中基因表达差异的结果表明,小麦拔节前和拔节后基部茎节中存在明显的基因表达差异(包括质和量的差异).从具有质的差异表达基因中挑选了4个基因进行cDNA片段(编号为WSRI～4)的克隆,测序和GenBank数据库序列同源性比对分析,结果显示,WSRI与大麦中编码Ser/Thr蛋白激酶的序列具有很高的同源性,WSR2的功能未知,WSR3高度同源于玉米中码Ty3/gypsy类Kg-座子反转录酶的序列,WSR4高度同源于小麦的端粒关联DNA.半定量RT-PCR技术分析拔节过程中克隆基因WSRl～4表达特性显示,除了WSR4以外,其余3个基因的表达模式和通过DD-RT-PCR分析所展示的差异表达趋势基本一致.     

中国野生毛葡萄芪合成酶基因克隆及表达分析

采用RT-PCR技术克隆中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因,命名为VqDSTS1,并进行序列及表达模式分析.结果表明:VqDSTS1基因cDNA编码区全长为1 179bp,GenBank登录号为JQ342086,编码392个氨基酸;氨基酸序列分析表明,VqDSTS1含有芪合成酶基因家簇的特征识别序列‘IPNSAGAIAGN’和‘GVLFGFG-PGLT’;序列比对显示,VqDSTS1与其他葡萄种质的芪合成酶氨基酸序列一致性在95.2%～98.7%之间;半定量RT-PCR分析表明,VqDSTS1受白粉病诱导表达,呈双峰模式.为进一步研究中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因家族的表达及功能分析提供了基础.     

灵芝甾醇14α-脱甲基酶基因的克隆及超量表达对三萜合成的影响

灵芝Ganoderma lucidum是我国传统的药用真菌,三萜类物质是灵芝的主要生物活性成分,甾醇14α-脱甲基酶是三萜合成途径中的关键酶。根据已报道其他物种甾醇14α-脱甲基酶的氨基酸保守序列设计简并引物,获得灵芝甾醇14α-脱甲基酶特异基因片段,并进一步获得灵芝甾醇14α-脱甲基酶基因的全长DNA和cDNA序列。其中DNA序列长1,981bp,cDNA序列长1,635bp。结构基因编码蛋白包含544个氨基酸,分子量为61.99kDa,等电点为6.36。将甾醇14α-脱甲基酶基因的cDNA序列克隆到灵芝超量表达载体pGl-GPD中,利用农杆菌介导的转化法实现了甾醇14α-脱甲基酶基因在灵芝内的超量表达。转化子的甾醇14α-脱甲基酶基因在转录水平表达量增加,三萜含量增加。进一步研究发现,三萜合成途径的关键酶基因Gl-aact、Gl-hmgr及Gl-ls的转录表达量也有所增加。     

大豆GmC4H基因的克隆及同源基因的生物信息学分析

本研究分别在大豆品种中豆27和九农20中克隆大豆肉桂酸-4-羟化酶基因(Glyma.20G114200),得到长度为1 797 bp的C4H基因c DNA序列。比对两者c DNA序列发现4个碱基差异位点。通过对二者氨基酸序列进行理化性质及结构与功能分析发现,C4H基因编码蛋白的5~24位氨基酸之间和32~55位氨基酸之间存在跨膜区域;C4H蛋白含有细胞色素P450结构域。大豆C4H基因的四个拷贝分别分布于第2、第10、第14和第20号染色体上,Glyma.20G114200与Glyma.10G275600的蛋白质同源性高,而另外两个同源基因Glyma.02G236500和Glyma.14G205200的蛋白质同源性高。结果表明,可能大豆4个C4H同源基因在进化过程中发生了功能的较大分化。     

菠菜14-3-3蛋白基因的克隆及硝酸盐胁迫下的表达分析

利用RT-PCR和RACE技术,从菠菜中首次获得了14-3-3蛋白基因的全长cDNA序列(GenBank登录号JX952165),命名为So14-3-3.该基因全长1 166 bp,开放阅读框801 bp,编码266个氨基酸.序列比对发现So143 3蛋白与其他植物14-3-3蛋白氨基酸序列一致性高达77.6％～84.7％.半定量RT-PCR表明,随NO3-胁迫处理时间的延长和浓度的增加,菠菜根和叶中So14-3-3基因的表达增强.实验构建了pGEX4T-So14-3-3原核表达载体,并通过IPTG诱导后获得分子量约为56 kD的蛋白.进一步的蛋白质印迹检测结果表明,随着NO3处理时间的延长和浓度的增加,So14-3-3蛋白表达也增加.该实验结果为进一步研究So14 3-3蛋白功能提供了基本的实验基础.