枯草芽孢杆菌bgls基因在酵母染色体上整合

将枯草杆菌β－1,3—1,4－葡聚糖酶基因(bgls)2．7kbEcoRl片段和酵母染色体Rdna片段克隆到整合型不含酵母自主复制序列(Autonomusly replicating sequence)的大肠杆菌／酵母菌穿梭质粒YIP5上,构建成YIP5-bgls—Rdna的杂种质粒PCZH,转化S．Cerevisiae并得到表达。稳定性测定表明．Y 33(PCZH101)和Y 33(PCZH104)在无选择压力的YEPD培养基中繁殖70代以上,两个转化子90％以上的酵母细胞仍含有质粒并且遗传特征与染色体行为相似。以bgls基因作探针;与酵母染色体DNA的Southern bloot分子杂交证实bgls基因已整合到酵母菌染色体上。     

在ADH1转录终止子区存在逆向复制叉移动的阻抑点

双向电泳定位复制叉技术是定位复制起点及分析复制叉移动过程的有力手段.用该技术分析了从酵母V号染色体克隆的pBY8-ARS在质粒上的复制起始功能 同时,构建了一个质粒模型包含ADH1启动子,终止子及βhCG-cDNA的转录单位,用双向电泳分析该转录单位逆向复制叉移动的情况. 首次证明,除rDNA以外,结构基因的终止区也存在逆向移动的复制叉的阻抑点,这为转录对逆向复制叉的移动具有阻抑作用的普遍性提供了证据.     

水稻核基因组DNA的YAC克隆和鉴定

将EcoRI部分消化的水稻(Oryza sativa L.)细胞核高分子量DNA电泳分部,回收大于200kb的片段,与内切酶消化过的酵母人工染色体(YAC)双质粒载体pJs97。pJS98DNA连接,转化酵母YPH252感受态原生质球,用ura^-,TrP^-双选择培养基直接筛选转化子,已获得2 000多个克隆。转化子DNA的southern杂交显示插入片段在200～820kb范围。     

ColE1型质粒DNA载体的复制与调控研究

ColE1型质粒DNA是独立于染色体之外能自主复制的一类双链DNA分子 ,用ColE1型质粒作DNA免疫或基因治疗载体 ,可以克服如同pSC10 1质粒载体的低拷贝 ,低产量的缺点 ,是目前最广泛使用的一种DNA载体 .预计到2 0 10年这方面产品市场的销售额将达到 450亿美元 ,因此研究ColE1型质粒DNA的复制与调控机理不仅有重要的科学意义也有重要的经济意义 .ColE1型质粒DNA复制起始区是一个约 60 0bp大小的区域 ,在这个区间中 ,DNA发生单向的复制 ,它的复制受到RNAⅡ、RNAⅠ、Rom蛋白及非荷载tRNA的调控 .RNAⅡ是起复制引物作用的RNA ,它…     

带有IS1的mini—F质粒所发动的染色体复制对于recA基因的依赖性

我们曾报道整合的F′质粒所发动的大肠杆菌染色体复制依赖于recA基因,而整合的F质粒则不。构建带有IS1的mini-F质粒,它们的复制起点分别来自F或F′质粒。这些质粒的整合抑制菌株中都有约20％是recA依赖的,不管这一mini-F质粒的复制起点来自F或F′质粒,也不管这一质粒在游离状态中的复制方向是单向或双向。实验结果说明,质粒的整合位置是决定由整合质粒所发动的染色体复制对recA基因的依赖性的主要因素。     

YAC克隆系统

目前,利用质粒和噬菌体作为载体,已完成了许多基因与基因组DNA片段的克隆及作图.但是,质粒和噬菌体所能携带的外源DNA片段的大小是很有限的.一般来说,入噬菌体能携带的DNA片段不超过25kb;Cosmid质粒所能携带的DNA片段不超过45kb.而现在发现的一些大基因,如人类的Factor VIII基因(180kb)和Dystrophin基因(1800kb)都已远远超过上述载体的克隆容量.这些容量较小的克隆载体,在克隆真核基因组的染色体时,遇到了巨大的困难.为了克服这一难题,80     

人工染色体

人工染色体丁志山,沃兴德（浙江中医学院分子医学研究所杭州３１０００９）基因是指ＤＮＡ分子上具有一定遗传学效应的特定核苷酸顺序,其载体是染色体。基因工程在初期只能操纵单个基因,而现在用同样的方法则可创建整个染色体——人工染色体,所谓的人工染色体即是人工...     

新酵母遗传学

基因克隆和酵母菌DNA转化技术已大大地加强了形式酵母遗传学的力量。现在已可能分离任何形式遗传学确定的基因,用离体产生的突变衍生物取代正常的染色体序列而任意改变酵母基因组,创造表现为自主复制子或小染色体的DNA分子。新酵母遗传学的这些独特的特征已用于研究真核分子生物学中的许多问题。     

GFP为报告基因的酵母哺乳动物细胞穿梭载体的构建及其在人血管内皮细胞中的表达

为研究酵母作为载体在口服基因治疗及免疫中的作用 ,需要一种能够在酵母中复制而在哺乳动物细胞中表达的穿梭载体 .利用通用载体质粒融合系统 (UPS)构建了一种以GFP为报告基因的新载体 ,以常规的氯化锂法对酿酒酵母进行转化 ,证明该载体能够在酵母中复制 ;以脂质体介导向人血管内皮细胞进行了转染 ,有绿色荧光 ,证明该载体能够在哺乳动物细胞中表达 .所获得的新型的穿梭载体为口服酵母在基因治疗中的应用提供了物质准备     

基因拷贝数与染色体位置对酵母表达乙肝病毒融合表面抗原SA-28基因的影响

应用ＦＬＰ重组酶介导的染色体定点整合技术,将带有不同拷贝数的乙肝病毒融合表面抗原ＳＡ－２８基因表达单元的质粒整合在酵母不同的染色体位点,并测定了ＳＡ－２８基因的表达情况,初步研究了基因拷贝数与染色体位置对酵母表达外源基因的影响。结果表明ＳＡ－２８基因在ＨＩＳ３位点整 合时的表达水平随基因拷贝数的增加而提高,遵循基因剂量效应;在某些染色体位点整２合时,插入方向对其表达有不同程度的影响,呈现出明显的染     

第三章 作为克隆载体的质粒

质粒的基本性质 质粒被广泛用作克隆载体。在本文讨论质粒的应用之前,回顾质粒的一些基本性质是合适的。质粒是复制子,能在染色体外稳定地遗传。应该强调的是,染色体外的核酸分子不一定是质粒。因为上面的定义含意是:遗传的同质性、单体的分子大小恒定、有能力独立于染色体而进行复制。因此,在巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中发现的     

利用游离型表达质粒强化毕赤酵母表达木聚糖酶

巴斯德毕赤酵母是用途广泛的蛋白表达系统。目前用于毕赤酵母的质粒主要以整合型质粒为主,很少见到游离的质粒用于外源基因的表达。文中通过将来源于酵母自身的自主复制序列连接到酵母整合型表达载体pGAP中构成自主复制的游离型表达载体pGAPZαA-PARS,将该载体用于表达木聚糖酶基因。转化毕赤酵母后同传统的整合型表达菌株相比,以甘油为碳源时最高酶活达到343 U/mL,比整合型表达提高了45.9%。同时游离载体表达重组酶比活相对整合表达提高了81.2%。为了节约发酵成本,进一步研究了分别以甘油、葡萄糖、蔗糖、混合碳源(蔗糖︰甘油=1︰2)等不同碳源下游离型重组菌株的表达水平。发现甘油表达水平最高,蔗糖最低,但是以工业葡萄糖为碳源时产酶成本最低。由于pGAP载体不需要以甲醇为碳源,因而文中所构建的游离载体pGAPZαA-PARS极大促进了毕赤酵母在食品行业中的应用。同时,游离型载体可大幅度提高表达水平,为进一步研究提高GAP启动子的高效表达奠定了基础。     

线形质粒

质粒是染色体外的遗传因子,是一种双链环状的DNA分子,质粒本身含有复制的遗传结构,能在细胞质中独立自主地进行自我复制。它是一个复制子。一些质粒也能整合到细菌染色体中随染色体的复制而复制。质粒一般都带有某些抗性基因。     

用人造微小染色体技术研究着丝粒和端粒的DNA结构与功能

为了在细胞世代中保持其稳定性,染色体起码应具备3个结构要素,那就是有一个DNA复制起点;一个着丝粒(ccntromere)使细胞分裂时两个姊妹染色单体能平均分配到子细胞里;最后,在染色体的两个末端必须有端粒(telomere),使DNA能完成复制。近年来人们采用分子克隆技术把真核细咆染色体的复制起点、着丝粒和端粒的DNA片段分别克隆成功。并且把它们互相搭配或改造而构成所谓“人造微小染色体”(aftificial minichromosomes),以研究这3种成分的结构与功能。 一、染色体复制起点 大肠杆菌质粒pBR322不能转化酵母细胞,因为pBR322上的DNA复制起点不能被酵母系统所识别,DNA不能复制。1979年Stinchcomb和Carbon实验室分别把带有遗传标记,例如Trp~+的酵母DNA的EcoRI片段插入pBR322,用来转化trp~-酵母,获得了带有质粒并能传代的Trp~+细胞。它们所含的质     

圆红冬孢酵母自主复制序列分离和利用游离型质粒进行基因敲除

【目的】与整合型表达载体相比,游离型表达载体通常具有更高的拷贝数以实现目标基因的高强度表达,并且对于DNA操作应用更加方便和灵活。然而,目前的研究尚未确定适用于圆红冬孢酵母的游离型质粒,该酵母外源基因的表达或者基于CRISPR/Cas9的基因组编辑都需要通过整合方式来完成,这也是对其遗传改造进展缓慢的一个重要原因。本研究目的是构建圆红冬孢酵母的游离型质粒,使得其外源基因的表达和基因组编辑更方便省时。【方法】首先对圆红冬孢酵母苯丙氨酸氨裂解酶基因(phenylalanine ammonia-lyase gene, PAL)中可能存在的自主复制序列(autonomously replicating sequences, ARSs)进行挖掘和表征,将该基因及其上下游序列进行分段扩增,构建到带有β-异丙基苹果酸脱氢酶基因(β-isopropyl malate dehydrogenase gene, LEU2)的质粒中,通过电转化的方法导入LEU2基因缺陷的圆红冬孢酵母中,根据转化效率高低鉴定了该酵母的一个ARS。其次,以编码香叶基香叶基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase, GGPPS)的BTS1基因为敲除靶点,将其gRNA构建到基于ARS的游离型质粒中,通过转化子直观的颜色变化来验证该游离型质粒是否成功应用于圆红冬孢酵母的CRISPR/Cas9体系。【结果】本工作鉴定了圆红冬孢酵母的ARS,构建了基于ARS元件的游离型质粒,并将该质粒应用于圆红冬孢酵母CRISPR/Cas9体系,成功实现了基于游离型质粒的基因敲除。【结论】本研究丰富了圆红冬孢酵母现有的工具库,为圆红冬孢酵母的合成生物学应用提供了良好的研究基础和技术支持。     

人类基因组分析中新的分子工具-YAC

通常用于ＤＮＡ克隆的载体,如质粒、λ噬菌体载体ｃｏｓ质粒（ｃｏｓｍｉｄ）等,其容量５０ｋｂ,对于多数基因或某些小的基因簇,这个容量是足够的。但对于人类基因组研究和某些大基因的克隆,这些载体就有相当的局限性。例如人类第Ⅷ因子基因编码凝血因子,它的缺陷可...     

一个从顶头孢霉中筛选具有启动子功能的DNA片段的简便方法

利用大肠杆菌一酵母穿梭质粒pGBT9构建了一个真菌启动子捕获载体pCBT14,用这个捕获载体构建了含顶头孢霉的0．5～2．0kb片段的染色体DNA文库,并从中筛选到顶头孢霉的24个DNA片段,这些片段能够在啤酒酵母中启动Trp1基因的表达。     

人基因组YAC分子克隆库的构建及DMD基因YAC克隆的筛选

以pYAC4为载体,以正常人白细胞和含4条X染色体的细胞株GM1414为DNA源构建成人基因组YAC(Yeast Artificial Chromosome,酵母人工染色体)分子克隆库,已得到原始克隆近2万个,插入DNA片段长度在400—1000kb,从其中选出一组YAC克隆,它们含有DMD基因全部DNA顺序。     

利用微波炉快速制备酵母质粒和基因组DNA PCR模板

制备基因组ＤＮＡＰＣＲ模板一般都比较费工费时 ,研究人员尝试用微波炉提取真核生物基因组ＤＮＡ ,然后做ＰＣＲ扩增取得了较好的效果[1 ,2 ] 。本文描述了一个利用微波炉快速制备酵母质粒和基因组ＤＮＡＰＣＲ模板的程序 ,具有良好的重复性。1　材料与方法1.1　材料酿酒酵母菌种 1ｃ163 6ｄａｒｇ11,ｕｒａ 3为比利时ＯｒｉａｎｅＳｏｅｔｅｎｓ馈赠。酵母载体ｐＹＸ13 3从美国康乃尔大学曹维国处获得 ,并由此构建了粗糙脉孢霉ａｒｇ 13ｃＤＮＡ的酵母表达载体ｐＹＸＡ5。培养基为ＳＤ或ＹＰＤ固体培养基。1.2　酵母质粒提取[3]取 1.5ｍｌ…     

生物技术简讯

人工染色体和高等真核生物的新型通用载体 应用自发复制的环状质粒(用于构建遗传操作载体)可促进细菌和酵母的遗传操作。但在天然的高等真核生物细胞中未发现这种环状质粒分子,且人们在构建真核生物的人工环状DNA载体的尝试上也未获成功。事实上,迄今为止也尚未获得一个令人满意的,有利于高等真核生物细胞遗传操作的自发性复制载体。因此,人们假定,理想的真核生物载体也许是呈线型的,可模拟一条染色体。为了实现这一目标,现