RhoA和血清反应因子(SRF)介导E1A激活基因阻遏子诱导人血管平滑肌细胞分化

为探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)对人血管平滑肌细胞(VSMCs)分化的调控机制,应用重组逆转录病毒表达载体pLNCX2( )/CREG及pLXSN(-)/CREG制备稳定感染HITASY细胞模型,观察CREG蛋白过表达及表达抑制对人VSMCs分化的影响并探讨其调控机制.结果显示:pLNCX2( )/CREG稳定感染细胞呈分化表型,细胞细长变成组织样聚集生长趋势,细胞中CREG蛋白和平滑肌分化标志蛋白平滑肌α-肌动蛋白(SMα-actin)表达显著增加,同时SMα-actin相关调控因子——血清反应因子(SRF)入核转位,RhoA总蛋白表达上调,以Rho激酶特异性抑制剂Y-27632作用后,CREG诱导的SMα-actin表达下调的同时SRF出核转位;pLXSN(-)/CREG稳定感染的细胞体积变大,细胞极性消失,呈无序生长,细胞中CREG和SMα-actin蛋白表达显著降低,同时伴有SRF出核转位及RhoA总蛋白表达下调.免疫共沉淀分析发现,CREG蛋白能被分泌到VSMCs培养基中表达,并可与细胞膜受体6-磷酸甘露糖/胰岛素样生长因子Ⅱ型受体(M6P/IGF2R)发生直接相互作用.用蛋白磷酸酶PP2A特异性抑制剂okadaicacid减少M6P/IGF2R在细胞膜表面分布,可明显抑制CREG过表达引起的RhoA、SRF和SMα-actin表达.上述结果提示,在体外培养的人VSMCs中,CREG可能作为一种分泌型蛋白质通过与细胞膜受体M6P/IGF2R相互作用,依次激活SMα-actin蛋白相关调控因子RhoA和SRF引起SMα-actin表达增加,促进VSMCs向分化表型转换.     

E1A激活基因阻遏子过表达诱导体外培养大鼠平滑肌细胞分化

为探讨E1A激活基因阻遏子蛋白(CREG)对血管平滑肌细胞表型转换的调控机制,应用pRC/CMV-hCREG真核表达载体转染体外培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs),观察了转染前后细胞的表型改变.结果发现,pRC/CMV-hCREG质粒转染后,大鼠平滑肌细胞增殖受抑,细胞分化标志蛋白SM α-actin表达显著增加.免疫共沉淀分析发现,CREG与血清反应因子(SRF)发生相互作用形成复合体,在CREG基因过表达时,与CREG结合的SRF蛋白增加.凝胶迁移阻滞分析(GSMA)和抗体凝胶迁移阻滞分析(supershift)显示,过表达的CREG蛋白与SRF蛋白共同结合到 SM α-actin基因启动子区CArG位点上,可能参与 SM α-actin表达的调控. 构建SM α-actin promoter- pCAT^® 3报告基因载体并与pRC/CMV-hCREG质粒共转染VSMCs也证实,CREG蛋白过表达可增强SM α-actin基因表达.上述研究提示,CREG蛋白可能是调控VSMCs表型转换的重要分子.     

胚胎干细胞来源的拟胚体分化早期血管平滑肌标志物的表达时相

目的:研究胚胎血管发育早期SMα-actin、SM22α、myocardin、平滑肌肌球蛋白重链(SMMHC)的表达规律,并初步探讨在此阶段血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)对血管平滑肌细胞(VSMCs)分化的影响。方法:采用转染平滑肌特异性蛋白SM22α启动子控制下表达增强型绿色荧光蛋白(GFP)报告基因载体的胚胎干细胞制备拟胚体(EBs),用免疫荧光染色、RT-PCR、Western blot分析SMα-actin、SM22α、myocardin、SMMHC的表达时相;然后分别用0μmol/L(对照组)、10μmol/L、50μmol/L AG1296(血小板源性生长因子受体抑制剂)处理EBs,观察三组SMα-actin、SM22α、myocardin、SMMHC在基因及蛋白水平上的表达变化。结果:胚胎血管发育早期SMα-actin、myocardin、SM22α、SMMHC分别在EBs第0(胚胎干细胞)、8、11、13d开始有表达。AG1296三种浓度处理后SMα-actin、myocardin、SM22α、SMMHC蛋白表达及myocardin、SM22α和SMMHC mRNA表达均无明显差异。结论:EBs发育过程中存在着自发的VSMCs分化,SMα-actin表达最早,依次为myocardin、SM22α、SMMHC;PDGF-BB对EBs分化早期VSMCs标志物表达的调控可能不是必要的。     

胚胎干细胞SM22α-EGFP表达克隆的建立及平滑肌细胞体外发育的动态观察

为探讨血管发育早期血管平滑肌细胞(VSMCs)募集和增殖特点,构建了含有SM22α启动子序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码序列的质粒,建立了平滑肌特异性蛋白SM22α启动子控制下稳定表达EGFP的胚胎干细胞株(ESCs),以研究VSMCs的发育特点.实验发现,起源于SM22α-EGFPESCs形成的胚胎小体(EBs)在第11天开启SM22α启动子并表达EGFP.此后EGFP阳性细胞持续增加,在第30天达到高峰.VSMCs多起源于EBs中细胞密集处,应用免疫荧光染色及RT-PCR观察到EGFP阳性细胞表达多种平滑肌特异性标志物.在贴壁培养的胚胎小体中VSMCs形态可分为纺锤形及上皮样的多角形,慢速视频显微摄像测得纺锤形细胞迁移速度较上皮形细胞快.以上结果表明,SM22α-EGFPESCs分化形成的EBs可以模拟体内早期胚胎血管形成过程,从形态学上获得VSMCs募集分化的证据.     

E1A 激活基因阻遏子促进人血管平滑肌细胞分化和迁移

为探讨 E1A 激活基因阻遏子 (cellular repressor of E1A-stimulated genes , CREG) 蛋白在人血管平滑肌细胞株 HITASY 分化和迁移中的调控作用,构建了重组逆转录病毒载体 pLNCX₂( ＋ )/CREG 和 pLXSN( － )/CREG. 以带绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein , GFP) 的空载体 pLNCX( ＋ )/GFP 和正常 HITASY 为对照,用磷酸钙共沉淀法将重组逆转录病毒载体转染 293 细胞,包装出完整的逆转录病毒后,感染 HITASY. 经 G418 筛选,获得稳定感染的细胞克隆 . 应用免疫荧光染色、蛋白质印迹等方法检测 CREG 和平滑肌分化标志蛋白α- 肌动蛋白 (SMα -actin) 表达,同时通过刮伤实验、慢速显微摄像技术检测细胞迁移能力以及用明胶酶谱方法分析细胞基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase , MMPs) 的活性 . 结果表明： pLNCX₂( ＋ )/CREG 稳定感染的 HITASY 中 CREG 和 SMα-actin 蛋白表达上调, MMP-2 和 MMP-9 活性升高,细胞迁移速度加快; pLXSN( － )/CREG 稳定感染的 HITASY 中 CREG 和 SMα -actin 蛋白表达下调, MMP-2 和 MMP-9 活性降低,细胞迁移速度减慢 . 上述研究提示 CREG 在诱导血管平滑肌细胞分化的同时促进细胞迁移 .     

转录因子E2F1抑制CREG表达调控体外培养的人血管平滑肌细胞分化

为探讨转录因子E2F1在血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型转化中的作用及其对E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)表达调控的分子机制,应用生物信息学方法,定位人CREG(hCREG)基因启动子并确定转录因子E2F1在hCREG启动子区的结合位点,PCR方法克隆并构建hCREG基因启动子绿色荧光报告基因载体,以hCREG启动子区E2F1结合位点为模板,化学合成E2F1寡聚脱氧核苷酸(ODN)和错配E2F1ODN,利用转录因子"诱骗(Decoy)"策略,用E2F1ODN转染体外培养的VSMCs以阻断E2F1与hCREG基因启动子区的结合,蛋白质印迹(Western blot)分析检测阻断前后细胞内hCREG蛋白、报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和平滑肌细胞分化标志蛋白SMα-actin表达变化.结果显示:分化表型HITASY细胞中E2F1表达下调伴出核转位,而增殖表型的HITASY细胞中E2F1蛋白表达明显增加且定位于核内.进一步应用FuGene6瞬时转染E2F1ODN和错配E2F1ODN于体外培养HITASY细胞中,蛋白质印迹分析发现,转染E2F1ODN后,HITASY细胞中hCREG、SMα-actin和GFP表达均较未阻断组及错配组细胞明显增加.上述研究结果证实,E2F1是hCREG基因转录的重要调控因子,能够直接结合于hCREG启动子区阻遏hCREG表达,参与hCREG蛋白对VSMCs表型转化的调控作用.     

E1A激活基因阻遏子(CREG)过表达通过抑制p38/JNK信号分子活化对抗人血管平滑肌细胞凋亡

血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡参与了动脉粥样硬化(AS)及冠状动脉介入治疗(PCI)术后再狭窄(RS)等心血管疾病的发生发展过程．E1A激活基因阻遏子(CREG)是新近发现的一种分泌型糖蛋白,在维持细胞和组织稳态方面发挥重要作用．前期研究发现CREG蛋白过表达能够对抗血清饥饿诱导的人血管平滑肌细胞(hVSMCs)凋亡,进一步探讨CREG对hVSMCs凋亡的调控作用及相关的分子机制．以逆转录病毒稳定转染的CREG过表达及表达抑制的hVSMCs为模型,应用两种药物Staurosporine (STS) 和Etoposide (VP-16) 诱导细胞发生凋亡,检测细胞凋亡和相关信号通路变化．结果显示,在药物干预后,CREG表达抑制时细胞凋亡明显增多,而CREG过表达明显抑制hVSMCs凋亡．同时也发现,CREG表达抑制时p38及JNK活性明显增强,而CREG过表达时p38和JNK活性被抑制．经腺病毒转染和药物干预抑制p38表达后,细胞凋亡均受到抑制,而且在p38活性被抑制的同时,JNK活化也受到抑制．说明p38和JNK表现为协同作用．结果也显示,VSMCs分化指标SM α-actin和SM MHC与CREG表达呈一致趋势,而细胞外基质蛋白Fibronection与CREG表达呈负相关．以上结果提示,CREG在维持VSMCs表型转换方面发挥重要作用,并且通过p38和JNK信号转导通路对hVSMCs凋亡进行调控．CREG可能对于AS和PCI术后RS的防治具有重要价值．     

胚胎干细胞分化形成囊状胚胎小体的形态学变化特征

目的观察胚胎干细胞R1(ESs)体外分化形成囊状胚胎小体(CEBs)及其血管内皮细胞和平滑肌细胞的时相规律和结构特点,探讨其在血管发育生物学研究中的作用和意义。方法体外悬浮培养ESs形成CEBs,采用HE染色观察CEBs的结构特点。用免疫荧光染色鉴定不同培养时间的CEBs中CASPASE-3的表达。加入全反式维甲酸(atRA)及联丁酰基cAMP(DBcAMP)定向诱导ESs分化,其后行平滑肌特异性标志物α-肌动蛋白(SMα-actin)及内皮细胞特异性标志物PECAM-1免疫荧光染色。结果典型的CEBs在第13d左右可以形成。第6d就可见CEBs中心部位出现调亡细胞,坏死腔开始形成,到第13d时中心坏死腔完全形成,凋亡细胞明显增多。将第6d的CEBs接种于培养皿后用atRA及DBcAMP处理,3d后可见SMα-actin染色阳性细胞。而未经处理的CEBs贴壁后,在第10d可见PECAM-1的表达。结论CEBs能够模拟体内血管发生形成的过程,可作为研究血管发育生物学的较好模型。     

血管外膜成纤维细胞诱导BMSCs向平滑肌细胞定向分化

观察大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)与血管外膜成纤维细胞(ad-ventitial fibroblasts,AF)直接接触培养后,BMSCs向血管成分细胞分化的情况.将BMSCs(DAPI标记)与外膜成纤维细胞按一定的比例混合培养7 d,BMSCs单独培养作对照,显微镜下观察细胞形态变化;用免疫荧光染色检测BMSCs的血管平滑肌细胞表型标志物肌动蛋白(SMα-actin)表达的情况;RT-PCR检测SMα-actin mRNA表达的情况.BMSCs与血管外膜成纤维细胞共培养后可见细胞核蓝染的BMSCs与SMα-actin表达阳性(红色)的双标细胞出现,且随培养时间的延长,BMSCs的SMα-actin表达阳性率增高.结果可见:与血管外膜成纤维细胞直接接触有诱导BMSCs向血管平滑肌细胞分化的趋势.     

大鼠胚胎发育期NBC1 在胰腺的表达与定位

目的:探讨碳酸氢钠协同转运载体(NBC1)在大鼠胰腺胚胎发育期不同阶段核酸、蛋白水平的动态变化以及在腺泡和β细胞的定位表达。方法:采用高密度寡核苷酸芯片对孕12.5 d(E12.5)、E15.5、E18.5、新生和成年胰腺进行基因转录水平分析,用RT-PCR和Western blot分别验证了NBC1核酸和蛋白在E15.5、E18.5、新生和成年时期胰腺中的表达情况,用Double fluorescence immunohistochemistry分析了NBC1在E18.5、新生和成年时期胰腺腺泡和β细胞的定位表达。结果:在大鼠胰腺胚胎发育过程中,NBC1核酸、蛋白在E18.5时特异高表达,新生下降直至成年最低;在腺泡基底侧膜和β细胞膜有强烈的阳性信号,且在成年胰腺中β细胞膜阳性信号较腺泡基底侧膜强。NBC1的表达变化与其功能近似基因的表达趋势相反,而与其协同发挥作用的基因及胰腺特异基因的表达趋势一致。结论:NBC1在胰腺发育过程中不仅与结构形成而且与功能发挥相关。