β-1,3-葡聚糖合成酶的提取及在抗真菌抗生素筛选中的应用

真菌病,尤其是有致命危险的深部感染真菌病随着易感染患者的增加而越来越多。一些条件致病菌,在机体免疫能力下降时,也成为重要的病原,但是,治疗真菌病至今没有理想的药物。真菌细胞壁结构和组成的特点,为筛选抗真菌药物提供了理想的靶位。真菌细胞壁主要由多糖构成,约占干重的80％,蛋白约占3％～20％,还有少量的脂、色素和无机盐。多糖是骨架,主要包括几丁质、葡聚糖和甘露聚糖,其含量和比例因菌不同而异。临床上的重要条件致病菌白色念珠菌(C.albicans)的细胞壁主要由葡聚糖和甘露聚糖构成,兼有少量几丁质,葡聚糖又以β—1,3—葡聚糖为主,这为以葡聚糖合成酶作为筛选真菌细胞壁合成抑制剂的靶酶提供了理论依据。     

β-1,3-葡聚糖酶在植物抗真菌病基因工程中的研究进展

β-1,3-葡聚糖酶是植物抗真菌病的重要抗性物质之一,植物β-1,3-葡聚糖酶可由病原物(如Mg)、化学因子(如水杨酸、乙烯、赤霉素)或物理因子(如紫外线照射、机械损伤)等多种生物因子和非生物因子诱导产生.将外源β-1,3-葡聚糖酶基因导入植物,可提高植物的抗真菌病害的能力;而将β-1,3-葡聚糖酶基因与其他防卫蛋白基因同时导入植物,将更大程度的提高植物的抗真菌病能力,是植物抗真菌病防治的有效新途径.文章中主要对β-1,3-葡聚糖酶的生物学特性、植物β-1,3-葡聚糖酶基因在转基因植株中的独立表达及其与其他抗真菌病基因的协同表达等进行了综述.     

β—1,3—葡聚糖酶的研究和应用

β-1,3-葡聚精酶的生产菌种由冻土毛霉经紫外线诱变获得,据正交试验确定培养条件。经硫酸铵盐析和SephadexG-100柱层析,酶得到纯化,并对酶的性质进行了研究。酶对酵母自溶有明显促进作用,使自溶产物的游离氨基氮含量、还原糖含量、总蛋白质得率、干物质得率均得以提高。     

青稞中β-1,3葡聚糖酶的纯化及部分性质研究

β-1,3-葡聚糖酶[EC．3．2．1．39]存在于大多数的高等植物中,它们由一个小的基因家族编码,在植物不同的生理活动中起着重要的作用。采用NaCl抽提、硫酸铵分部沉淀和2步离子交换法和分子筛从青稞的胚芽中提纯得到了一种β-1,3-葡聚糖酶。在非变性电泳中纯化的β-1,3-葡聚糖酶用银染只有一条蛋白带,运用底物进行的活性染色时在相同位置也只显示一条酶活性带。此活性染色可以直接在电泳胶板上快速鉴定和检验β-1,3-葡聚糖酶。纯化的β-1,3-葡聚糖酶在还原及非还原条件下的SDS-PAGE变性电泳中,呈现一条分子量为32kD的主要蛋白带及2条低分子量的弱带,表明此酶无链内二硫键存在。等电聚焦分析显示其等电点为8．1。上述结果表明纯化得到的是一种碱性β-1,3-葡聚糖酶。     

几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因研究进展

几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶是重要的水解酶,实践证明,转几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因植物能比较有效地抵抗真菌侵染。本综述了几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶结构分类、抗真菌机理．及其近年来在抗黄曲霉病研究中的应嗣研究,并对今后的研究及应用进行了预测。     

β-1,3-葡聚糖酶的研究和应用

β-1,3-葡聚精酶的生产菌种由冻土毛霉经紫外线诱变获得,据正交试验确定培养条件。经硫酸铵盐析和SephadexG-100柱层析,酶得到纯化,并对酶的性质进行了研究。酶对酵母自溶有明显促进作用,使自溶产物的游离氨基氮含量、还原糖含量、总蛋白质得率、干物质得率均得以提高。     

连续温度变化对β-1,3-葡聚糖酶酶解酵母β-葡聚糖的影响

为了探索反应温度对产物组分的影响,利用自制连续变化的温度梯度实验装置,研究了22 ℃~60 ℃ (±0.1 ℃) 区间内温度对一内切β-1,3-葡聚糖酶酶解酵母β-葡聚糖的影响,获得了酶解过程多点温度特性数据。分析表明：该酶酶解酵母β-葡聚糖的活化能为84.17 kJ/mol;以产物积累表示的最适酶解温度随时间延长呈指数下降;酶解产物组分受温度的影响,低温较高温获得的寡糖链长,高温区大于46 ℃可以获得以昆布二糖、昆布三糖为主的组分,而低温区小于30 ℃可以获得昆布五糖及更大分子量的产物。研究结果可为寡糖     

转β-1,3-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因棉花

为了提高棉花的抗枯、黄萎病的能力,用花粉管通道法,将烟草β-1,3-葡聚糖酶基因和菜豆几丁质酶基因导入棉花,获得了抗卡那霉素的转化植株。经PCR、PCR－Southern Blot检测,证明两种基因已插入到棉花基因组中。     

产β-1,3-葡聚糖酶植物内生放线菌的筛选及抑菌活性研究

本研究采用透明圈法, 对217株植物内生放线菌产β-1,3-葡聚糖酶进行了检测, 结果表明: 45.6%的菌株能够产生β-1,3-葡聚糖酶, 黄瓜内生放线菌中的产酶菌株最多为38个; 不同植物来源的内生放线菌中具有产β-1,3-葡聚糖酶能力的菌株比例不同, 其中黄精中的产酶菌株比例最高, 达到88.9%。产酶菌株粗酶液对油菜菌核病菌的抑菌活性测定结果发现, 36个产酶菌株的粗酶液表现出不同程度的抑制作用, 占总产酶菌株的36.4%, 其中菌株gCLA4的粗酶液能够完全抑制病菌菌丝生长。对gCLA4菌株产酶     

微生物1,3-1,4-β-葡聚糖酶蛋白质改造及工业应用研究进展

1,3-1,4-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.73)是一种重要的工业用酶,其可以通过特异性切割毗邻β-1,3-糖苷键的β-1,4-糖苷键将β-葡聚糖或地衣多糖降解为纤维三糖和纤维四糖。微生物β-葡聚糖酶属于糖苷水解酶家族16,其三维结构为卷心蛋糕状的逆向β-片层结构。文中综述了近些年来β-葡聚糖酶在工业上的应用情况及酶蛋白质工程改造的研究进展,并对其研究前景进行了展望。     

燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ基因 3'端cDNA的克隆及分析

实验利用3'-RACE技术进行燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ(Oglc13Ⅱ)3'末端cDNA的快速扩增并进行序列分析.将0.01%的HgCl2诱导处理24h之后的燕麦(Avena Sativa)幼叶作为材料,利用RT-PCR技术得到Oglc13Ⅱ的部分cDNA片段,根据此片段设计一条特异性上游引物,反转录引物中的部分序列即3'sites Adaptor Primer作为下游引物,按3'RACE试剂盒(Takara)操作流程进行Oglc13Ⅱ3'末端cDNA的快速扩增,成功获取837bp的3'-RACE反应产物,通过BLAST技术,发现该片段与许多植物β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高的相似性(50.0%～72.0%).因此认为成功克隆了Oglc13ⅡcDNA的3'末端序列.     

木霉β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化

目的:对木霉菌株LE02所产β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化方法进行研究。方法:粗酶液分别用硫酸铵、乙醇和丙酮进行沉淀,再用DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析进一步分离纯化,并用SDS-PAGE法测其分子量。结果:硫酸铵分段盐析法沉淀酶蛋白的效果优于乙醇和丙酮沉淀;盐析得到的酶蛋白经透析浓缩后,再经DEAE-Sepharose CL-6B层析分离,可得到单一酶蛋白,总酶活回收率达78.71%,比酶活达到689.9U/mg,提高了53.74倍,经SDS-PAGE法测得该β-1,3-葡聚糖酶的分子量为80.137kDa。结论:采用硫酸铵分段盐析和离子交换层析法可获得电泳纯的β-1,3-葡聚糖酶,且酶活回收率高。     

拟青霉内切β-1,3(4)-葡聚糖酶基因克隆、表达及重组酶性质

采用改造的酿酒酵母表达载体pYES2-GSL构建了拟青霉Paecilomyces sp. FLH30表达cDNA文库, 刚果红平板法筛到一内切β-1,3(4)-葡聚糖酶基因(PsBg16A), 全长cDNA为1 217 bp, 完整开放阅读框(ORF) 951 bp, 编码316个氨基酸, 属于糖苷水解酶16家族。去信号肽的PsBg16A克隆入表达载体pET28a(+)并在E. coli BL21成功表达, 经16 °C 20%乳糖诱导24 h, 酶活达482 U/mL。重组PsBg16A可水解大麦葡聚糖、地衣多糖和昆布多糖, 显示PsBg16A为典型的β-1,3(4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6), 重组酶最适pH和温度分别为7.0和65 °C, 对大麦葡聚糖、地衣多糖和昆布多糖的Km 分别为3.12、4.86和10.32 g/L。     

生防木霉菌β-1,3-葡聚糖酶活性研究

通过采取还原糖法对生防木霉菌真菌2号和真菌4号菌株在不同发酵时间产β-1,3-葡聚糖酶活性进行测定,对其产β-1,3-葡聚糖酶特性进行初步研究。结果表明,同一菌株在不同发酵时间β-1,3-葡聚糖酶活性大小变化的趋势大致相同,并均在培养72 h时β-1,3-葡聚糖酶活性达到最大,在相同发酵时间,真菌2号菌株比真菌4号菌株的β-1,3-葡聚糖酶活性要高。     

番茄感染TMV诱导的β-1,3-葡聚糖酶的纯化和性质

番茄系统感染TMV诱导对胞外β—1,3—葡聚糖酶活性升高。番茄叶胞外提取液经冰冻干燥浓缩、-20℃丙酮沉淀、CM-Sephadex C-25离子交换层析和PBE 94聚焦层析纯化,获得PAGE和SDS-PAGE均一的β—1,3—葡聚糖酶。测得该酶的分子量为22kD;以昆布多糖为底物,该酶的最适pH5.4,最适温度30～40℃;K_m和V_(max)值分别为5.64mg/ml和 0.328nmol/s。在感染TMV的番茄叶中,β—1,3—葡聚糖酶活力大部分位于胞外,它是番茄叶胞外提取液中主要的病原相关蛋白。     

天麻球茎几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的初步研究

天麻(Gastrodia elata)是真菌寄生植物。密环菌侵入初生球茎并在其皮层被消化,营养物供次生球茎生长需要;密环菌不能侵染生长小的次生球茎。我们从初生球茎分离并纯化了几丁质酶和β—1,3—葡聚糖酶,分子量各为31.5 kD和94kD,得率各为0.8和0.4 mg/100 g鲜重。纯化几丁质酶的内切酶比活为208 nmol GlcNAc s~(-1)mg~(-1),外切酶比活为4.1 nmol GlcNAcs~(-1)mg~(-1);纯化葡聚糖酶比活为546 nmol Glc s~(-1)mg~(-1)。以相同鲜重计,初生球茎中二种酶的总活性各为次生球茎的34和56倍;这主要是由于次生球茎的酶比活性很低。二种酶对平板上培养的木霉菌丝的生长均有抑制作用,但抑菌活性均较天麻抗真菌蛋白(GAFP)低。我们认为这两种酶在天麻初生球茎消化密环菌菌丝的过程中起重要作用,而对天麻球茎阻止和限制密环菌侵染的抗菌作用贡献甚少,后者主要属于天麻抗真菌蛋白。     

系统感染TMV的番茄叶胞外β-1,3-葡聚糖酶

系统感染ＴＭＶ （ｔｏｂａｃｃｏ ｍ ｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）的番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｍｉｌｌ．）叶胞外蛋白提取液经冰冻干燥浓缩、－ ２０℃丙酮沉淀、ＣＭ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ－２５离子交换层析、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５离子交换层析和Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５凝胶层析纯化,获得ＰＡＧＥ均一的β－１,３－葡聚糖酶．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证明,它包含分子量为３６ ｋＤ 和２７ ｋＤ的两个同工酶．以昆布多糖为底物,酶的最适ｐＨ 在４．８—５．２之间,在ｐＨ ４—８稳定;酶的最适温度在３０—４０℃之间,在４０℃保温１ｈ 后酶活性不变;Ｋｍ 值为９．２ ｍ ｇ／ｍ Ｌ．在系统感染ＴＭＶ 的番茄叶胞外蛋白提取液中,有分子量为２２ ｋＤ、２７ ｋＤ和３６ ｋＤ的３个β－１,３－葡聚糖酶同工酶     

表达β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶基因的转基因烟草及其抗真菌病的研究

利用烟草碱性β－１,３－葡聚糖酶及菜豆碱性几丁质酶基因构建了组成型表达的双价植物表达载体ｐＢＬＧＣ,利用农杆菌介导法转化了烟草,并得到了转基因植株。对其进行分子生物学分析的结果表明,部分转基因植株在所有检测中都显示较强的阳性反应,这说明外源基因已整合到烟草基因组中得到正确表达。活体接菌实验初步表明,转基因植株与对照相比,对赤星病的侵染具有较强的抵抗能力。     

燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ基因3′端cDNA的克隆及分析

实验利用3′-RACE技术进行燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ(Oglc13Ⅱ)3′末端cDNA的快速扩增并进行序列分析。将0.01%的HgCl2诱导处理24h之后的燕麦(Avena Sativa)幼叶作为材料,利用RT-PCR技术得到Oglc13Ⅱ的部分cDNA片段,根据此片段设计一条特异性上游引物,反转录引物中的部分序列即3′sites Adaptor Primer作为下游引物,按3′RACE试剂盒(Takara)操作流程进行Oglc13Ⅱ3′末端cDNA的快速扩增,成功获取837bp的3′-RACE反应产物,通过BLAST技术,发现该片段与许多植物β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高的相似性(50.0%~72.0%)。因此认为成功克隆了Oglc13ⅡcDNA的3′末端序列。     

燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ基因 3'端cDNA的克隆及分析

实验利用3＇-RACE技术进行燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ（Oglc13Ⅱ）3＇末端cDNA的快速扩增并进行序列分析.将0.01%的HgCl2诱导处理24h之后的燕麦（Avena Sativa）幼叶作为材料,利用RT-PCR技术得到Oglc13Ⅱ的部分cDNA片段,根据此片 段设计一条特异性上游引物,反转录引物中的部分序列即3＇sites Adaptor Primer作为下游引物,按3＇RACE试剂盒（Takara）操作流程进行Oglc13Ⅱ3＇末端cDN A的快速扩增,成功获取837bp的3＇-RACE反应产物,通过BLAST技术,发现该片段与 许多植物β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高的相似性（50.0%～72.0%）.因此认为成功 克隆了Oglc13ⅡcDNA的3＇末端序列.