辅酶Ⅰ及其类似物的质子核磁共振研究

在5mM浓度下,测定了NAD~ 、εNAD~ 、NMN~ 、εAMP和(εAMP RMN~ )混合物的化学位移与pH依赖关系。根据环流各向异性屏蔽效应,通过比较εNAD~ 与等量混合物(εAMP NMN~ )的对应碱基质子化学位移,以及比较εNAD~ 与NAD~ 的烟酰胺质子化学位移,发现在水溶液中的游离NAD~ 以pK_a3.88为转折,处于不同构象:在pH3.88以下,NAD处于伸展构象;在此值以上,NAD~ 处于折迭构象。     

蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的研究 Ⅲ.萤光衍生物的生成

蛇肌CM-Apo-GAPDH在NAD~ 存在的条件下,经紫外光照产生萤光衍生物。其校正发射光谱峰值在420nm,校正激发光谱呈三峰形,峰值在240nm、285nm、325nm。蛇肌GAPDH萤光衍生物生成的最适条件为:在pH7.6～8.0的缓冲液中光照8分钟,NAD~ 与酶克分子浓度的比值为60。用325nm激发、410nm发射的萤光滴定测NAD~ 与CM-GAPDH的结合,表明由于蛇肌GAPDH羧甲基化使NAD~ 与酶的结合所表现的负协同性变得弱得多。萤光衍生物A_(280)/A_(260)为1.61～1.63,相当于蛇肌GAPDH萤光衍生物每分子中的四个亚基含有二分子NAD~ ,蛇肌GAPDH萤光衍生物的生成也属于半位反应。     

龙虾肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶及其衍生物与NAD~+的结合

平衡柱层析法测得每分子龙虾肌羧甲基化甘油醛-3磷酸脱氢酶能结合3.9分子NAD~+,而每分子光照酶则只能结合2分子NAD~+。 由蛋白荧光淬灭法得到,在25℃、pH7.0的磷酸盐缓冲液中,全酶、羧甲基酶及光照酶与NAD~+结合时均呈负协同性。     

蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的研究——Ⅲ.萤光衍生物的生成

蛇肌CM-Apo-GAPDH在NAD~ 存在的条件下,经紫外光照产生萤光衍生物。其校正发射光谱峰值在420 nm,校正激发光谱呈三峰形,峰值在240 nm、285nm、325nm。蛇肌GAPDH 萤光衍生物生成的最适条件为:在pH7.6～8.0的缓冲液中光照8分钟,NAD~ 与酶克分子浓度的比值为60。用325nm 激发、410nm 发射的萤光滴定测NAD~ 与CM-GAPDH 的结合,表明由于蛇肌GAPDH 羧甲基化使NAD 与酶的结合所表现的负协同性变得弱得多。萤光衍生物A_(280)/A260为1.61～1.63,相当于蛇肌GAPDH 萤光衍生物每分子中的四个亚基含有二分子NAD~ ,蛇肌GAPDH 萤光衍生物的生成也属于半位反应。     

蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的研究——Ⅱ.蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶和兔肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶稳定性的比较

本文比较了蛇肌GAPDH和兔肌GAPDH的稳定性。发现蛇肌Apo-GAPDH的热稳定性比兔肌Apo-GAPDH 和Holo-GAPDH 强。蛇肌Apo-GAPDH 的“熔点”为62.5℃。C,兔肌Apo-GAPDH 的“熔点”为52.5℃。55℃蛇肌Apo-GAPDH 的热失活速度比兔肌Apo-GAPDH 小得多,蛇肌Apo-GAPDH 活力损失一半的时间(t_(1/2)为1.2小时;兔肌Apo-GAPDH t_(1/2)为1.4分。Holo-GAPDH t_(1/2)为2.6分。热失活速度符合一级反应作图。底物存在热失活速度变小,NAD~ 对热失活的保护作用最大,当[NAD~ ]/[E]=240时,热失活速度蛇肌GAPDH 小32倍,兔肌GAPDH 小165倍,但蛇肌GAPDH 仍比兔肌GAPDH 稳定。蛇肌GAPDH 与兔肌GAPDH 的最适pH 相同,pH 稳定性蛇肌GAPDH 比兔肌GAPDH 强。蛇肌Apo-GAPDH 在pH4.9～9.4稳定,兔肌Apo-GAPDH 的pH 稳定范围在pH6.1～8.1。ATP 在0℃也引起蛇肌GAPDH 失活,失活速度比兔肌GAPDH 小。结果表明蛇肌GAPDH 比兔肌GAPDH 稳定性强、结构紧密、亚基间结合力强。     

在不同物理化学条件下天花粉蛋白的圆二色性研究

用圆二色谱研究了天花粉蛋白在酸性和碱性溶液中的构象,并观察了在十二烷基磺酸钠(SDS)溶液中天花粉蛋白分子构象的变化,用Chen,Yang与Martinez等人的方法计算了各种条件下天花粉蛋白二级结构含量.结果表明:在很宽广的pH范围内(从pH2到pH12)分子构象基本上是稳定的.但是,在强碱性条件下即pH>12(室温)或pH11.5(40℃)螺旋含量显著减少.在碱性条件下,于250nm附近出现一新的CD带,它的强度与离解的酪氨酸残基个数呈线性关系,说明这一新带主要是由离解的酪氨酸残基产生的.     

一株螢光假单孢杆菌(Pseudomonas fluorescens)中6-磷酸葡萄糖脱氢酶对烟酰胺核甙酸辅酶的专一性

在一株萤光假单孢杆菌SM-102菌株中G-6-P脱氢酶能同时利用NADP~+和NAD~+作为氢递体,并非象以往文献所载在G-6-P脱氢酶催化G-6-P的氧化中所引起NAD~+的还原是由于烟酰胺核甙酸转氢酶的作用所致,这个结论是根据下列的试验结果: (一)经测定在细菌的无细胞抽提液中没有找到烟酰胺核甙酸转氢酶的存在。(二)电泳纯的酶制剂亦能同时利用NADP~+和NAD~+作为氢递体。(三)在酶的纯化过程中,G-6-P脱氢酶作用于NADP~+和NAD~+的还原速率比值始终保持在2左右。(四)G-6-P脱氢酶作用于过量辅酶的反应系统时,对NADP~+的还原速率约为NAD~+的二倍,但当NADP~+和NAD~+同时存在时,还原速率仍与NADP~+相等。作者对G-6-P脱氢酶能同时以NADP~+与NAD~+作为辅酶在糖代谢演化上的意义进行了讨论。     

酵母的综合利用——从生产辅酶A下脚水中提取辅酶Ⅰ的简便方法

辅酶Ⅰ又名烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Diphosphate:NAD~ )分子式为C_(21)H_27O_(14)N_7P_2,分子量为663;等电点为3.0;化学结构如下:     

蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的研究 Ⅱ.蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶和兔肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶稳定性的比较

本文比较了蛇肌GAPDH和兔肌GAPDH的稳定性。发现蛇肌Apo-GAPDH的热稳定性比兔肌Apo-GAPDH和Holo-GAPDH强。蛇肌Apo-GAPDH的“熔点”为62.5℃,兔肌Apo-GAPDH的“熔点”为52.5℃。55℃蛇肌Apo-GAPDH的热失活速度比兔肌Apo-GAPDH小得多,蛇肌Apo-GAPDH活力损失一半的时间(t_(1/2))为1.2小时;兔肌Apo-GAPDH t_(1/2)为1.4分。Holo-GAPDH t_(1/2)为2.6分。热失活速度符合一级反应作图。底物存在热失活速度变小,NAD~ 对热失活的保护作用最大,当[NAD~ ]/[E]=240时,热失活速度蛇肌GAPDH小32倍,兔肌GAPDH小165倍,但蛇肌GAPDH仍比兔肌GAPDH稳定。蛇肌GAPDH与兔肌GAPDH的最适pH相同,pH稳定性蛇肌GAPDH比兔肌GAPDH强。蛇肌Apo-GAPDH在pH4.9～9.4稳定,兔肌Apo-GAPDH的pH稳定范围在pH6.1～8.1。ATP在0℃也引起蛇肌GAPDH失活,失活速度比兔肌GAPDH小。结果表明蛇肌GAPDH比兔肌GAPDH稳定性强、结构紧密、亚基间结合力强。     

蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的研究 Ⅰ.纯化和一些基本性质

用硫酸铵分级、DEAE-纤维素柱层析、羧甲基纤维素柱层析分离和纯化了蛇肌GAPDH。聚丙烯酰胺凝胶电泳和醋酸纤维素薄膜电泳均为一条带。用此法提纯的蛇肌GAPDH A_(280)/A_(260)为2.1,是Apo-GAPDH。在纯化的Apo-GAPDH中加入NAD~ 能够得到结晶。Sephadex G-150凝胶过滤法测得蛇肌GAPDH的分子量约为150,000。十二烷基硫酸钠凝胶电泳也为一条带,亚基分子量约为38,000。表明蛇肌GAPDH是由相同的四个亚基组成的。用Ferdinand法测得比活为100。蛇肌GAPDH的N-末端氨基酸为缬氨酸。每分子含巯基数、色氨酸和酪氨酸残基数分别为12、12和36。重量法测得蛇肌Apo-GAPDH消光系数E_(280)~(0.1%)为0.775;Holo-GAPDH的消光系数E_(280)~(0.1%)为1.02。蛇肌GAPDH对甘油醛-3-磷酸的米氏常数为1.67×10~(-3)M,对NAD~ 的米氏常数为1.11×10~(-4)M。NAD~ 与蛇肌Apo-GAPDH结合后有Racker带,每分子蛇肌GAPDH可结合4分子NAD~ ,酶与NAD~ 的结合表现为负协同性。蛇肌GAPDH的圆二色谱,近紫外区Apo-GAPDH在285nm处有一负峰,292nm、270nm处有肩。加入NAD~ 后负峰变大并且蓝移。NAD~ 的加入似乎影响了酪氨酸所处的微环境。远紫外区Apo-GAPDH在220nm处有一负峰,208nm处有一个肩;加入NAD~ 后,负峰值稍稍变大,但峰的位置和形状未变。表明蛇肌GAPDH中,含较多的β-折迭,较少的α-螺旋。NAD~ 的加入对二级结构影响不大。     

胰岛素的核磁共振研究——苯丙氨酸共振峰的确定与测链构象

以同核相关二维谱(COSY),双共振技术,去(B_(23)-B_(30))一胰岛素(DOI)测定为基础,分析确定去锌猪胰岛素的三个重要的苯丙氨酸残基B_1 ,B_(24),B_(25)的400 MHz ~1H NMR共振峰及其在不同pH值时的侧链构象.发现在高pH值时,处于单体一单体聚合界面的苯丙氨酸B_(24)侧链构象变化最大.     

蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的研究——Ⅰ.纯化和一些基本性质

用硫酸铵分级、DEAE-纤维素柱层析、羧甲基纤维素柱层析分离和纯化了蛇肌GAPDH。聚丙烯酰胺凝胶电泳和醋酸纤维素薄膜电泳均为一条带。用此法提纯的蛇肌GAPDH A_(280)/A_(260)为2.1,是Apo-GAPDH。在纯化的Apo-GAPDH 中加入NAD~ 能够得到结晶。Sephadex G-150凝胶过滤法测得蛇肌GAPDH 的分子量约为150,000。十二烷基硫酸钠凝胶电泳也为一条带,亚基分子量约为38,000。表明蛇肌GAPDH 是由相同的四个亚基组成的。用Ferdinand 法测得比活为100。蛇肌GAPDH 的N-末端氨基酸为缬氨酸。每分子含巯基数、色氨酸和酪氨酸残基数分别为12、12和36。重量法测得蛇肌Apo-GAPDH 消光系数E_(280)~(0.1)%为0.775;Holo-GAPDH 的消光系数E_(280)~(01.)为1.02。蛇肌GAPDH 对甘油醛-3-磷酸的米氏常数为1.67×10~(-8)M,对NAD~ 的米氏常数为1.11×10~(-4)M。NAD~ 与蛇肌Apo-GAPDH 结合后有Racker 带,每分子蛇肌GAPDH 可结合4分子NAD~ ,酶与NAD~ 的结合表现为负协同性。蛇肌GA PDH 的圆二色谱,近紫外区Apo-GAPDH 在285nm 处有一负峰,292nm、270nm 处有肩。加入NAD 后负峰变大并且蓝移。NAD~ 的加入似乎影响了酪氨酸所处的微环境。远紫外区Apo-GAPDH 在220nm 处有一负峰,208nm 处有一个肩;加入NAD~ 后,负峰值稍稍变大,但峰的位置和形状未变。表明蛇肌GAPDH中,含较多的β-折迭,较少的α-螺旋。NAD~ 的加入对二级结构影响不大。     

利用~1H-NMR模拟谱研究二核苷酸A3′P(CH_3)5′A的构象性质

本文根据Altona等人的方法,在利用~1H-NMR模拟谱确定18℃、40℃、70℃三种温度下有关质子化学位移及偶合常数的基础上,分析了A3′P(CH_3)5′A的两种非对映异构体a和b的构象状态。它们与A3′P(OH)5′A相比发现:(1)在18℃时两个核糖环是S型构象占主要成分,并随温度升高S型构象成分增多;(2)磷酸骨架的扭角ε′和β′分别改变±15°及±4°;(3)在优势构象情况下,两个核糖环都部分重叠,而且A3′P(CH_3)5′A(a)的重叠程度比A3P′(CH_3)5′A(b)小;(4)腺嘌呤碱基都更倾向去堆积状态,而且随温度升高A3′P(CH_3)5′A(a)比A3′P(CH_3)5′A(b)有着更强的去堆积效应。     

利用~1H-NMR模拟谱研究二核苷酸A3′P(CH_3)5′A的构象性质

本文根据Altona等人的方法,在利用~1H-NMR模拟谱确定18℃、40℃、70℃三种温度下有关质子化学位移及偶合常数的基础上,分析了A3′P(CH_3)5′A的两种非对映异构体a和b的构象状态。它们与A3′P(OH)5′A相比发现:(1)在18℃时两个核糖环是S型构象占主要成分,并随温度升高S型构象成分增多;(2)磷酸骨架的扭角ε′和β′分别改变±15°及±4°;(3)在优势构象情况下,两个核糖环都部分重叠,而且A3′P(CH_3)5′A(a)的重叠程度比A3P′(CH_3)5′A(b)小;(4)腺嘌呤碱基都更倾向去堆积状态,而且随温度升高A3′P(CH_3)5′A(a)比A3′P(CH_3)5′A(b)有着更强的去堆积效应。     

大肠杆菌NAD+合成关键酶的克隆表达及发酵优化

【目的】烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD~+)在细胞基因表达、氧化还原反应、能量代谢以及调控细胞生命周期中具有重要的作用,其细胞内含量是能量效率的关键因素。强化辅因子合成策略,获得高产NAD~+菌株,对于NAD~+依赖型氧化还原反应的速率和调节相关生化合成途径的代谢流具有重要意义。【方法】首先通过内源性调节,对代谢途径中的关键酶基因进行强化,过量表达和共表达NAD~+合成途径中的关键酶基因pncB、nadD和nadE;其次,通过外源调节增加NAD~+前体物,优化诱导条件提高发酵过程中关键酶的表达量,增加NAD~+的合成量;最后在单因素优化试验的基础上,以NAD~+含量为响应值,采用Box-Bohnken试验设计方法,研究3个显著性影响因素相互作用对NAD~+积累量的影响,确定最佳的优化条件。【结果】根据关键酶基因强化策略,构建了7株重组菌,其中重组菌E.coli BL21/p ET-21a-nad E-pncB胞内NAD~+含量相比初始菌株E.coli BL21/pET-21a提高了405.2%。通过对该菌株诱导条件和NAD~+合成前体的优化,使用Design Expert 8.0分析实验数据,得出该重组菌株的最佳发酵条件为:诱导温度控制在15–20 oC,OD_(600)为0.6–0.8时添加IPTG 0.63 mmol/L、烟酸15.8 mg/L、诱导时长控制在24 h。NAD~+含量在最优条件下实验验证值可达43.16μmol/g DCW,与优化前相比提高了123.6%,与初始菌株相比提高了1029.8%。【结论】在大肠杆菌中共表达关键酶基因pncB和nadE,胞内NAD~+合成量明显增加,前体物以及诱导条件的外源调节使NAD~+积累量达到最佳优化值。实现了提高NAD~+含量的目标,胞内辅因子浓度的增加为提高生物催化效率奠定了可行性基础。     

蛋白质溶液中构象,构象组装及构象动态学

蛋白质结构与功能关系的研究一直是生物化学和分子生物学领域内的一个主要课题。蛋白质分子结构的最重要特点是它不仅有一定的化学结构,而且有特定的空间结构,即构象。蛋白质的功能与特定的构象紧密相关,而且在蛋白质发挥功能的过程中常常伴随有构象的动态变化过程。由于生物体内蛋白质发挥作用的环境是生理pH条件下的水溶液,因此研究蛋白质在溶液状态下的构象及构象变化,对阐明蛋白质结构与功能关系是至关重要的。     

细胞内NAD~+水平分析方法的研究进展

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD~+)是存在于所有活细胞中的必需吡啶核苷酸。NAD~+作为一种重要的辅酶和底物,参与能量产生、DNA修复、基因表达、钙依赖的二级信使信号和免疫调节作用等多种生物学过程。NAD~+代谢长期失衡会扰乱机体的生理功能,导致代谢性疾病、神经退行性疾病以及癌症的发生。NAD~+的水平随着老龄化以及年龄相关性疾病的发生逐渐降低。最近的研究表明,提高细胞内NAD~+水平是延缓衰老,预防年龄相关退行性疾病的一种有前景的方法。尽管细胞内NAD~+代谢与人类健康和疾病密切相关,但NAD~+含量的检测极具挑战性。目前为止,开发了多种用于定量分析细胞内NAD~+水平的分析方法。该文就细胞内NAD~+水平分析方法作一综述,着重分析近年来国内外细胞内NAD~+水平检测的研究进展以及提出未来NAD~+定量分析所需解决的问题。     

组氨酸质子化触发病毒膜融合及其分子机制

膜融合是有包膜病毒入侵靶细胞的关键步骤,低pH、受体结合、二者兼具或其他尚未界定的机制均可触发病毒融合蛋白的构象重排,介导病毒包膜与靶细胞膜或内体膜间的融合。组氨酸(histidine,His)残基是唯一一个质子化状态变化(pKa~6~7)接近于病毒融合阈值(~pH6)的氨基酸,参与多种低pH依赖的病毒融合蛋白构象转变及膜融合,对其可能作用机制的阐述将有助于抗病毒药物的研制与发展。     

去B链羧端五肽胰岛素的结构研究 Ⅴ.用萤光探针1,8-TNS对疏水区的初步研究

1,8-TNS与溶剂极性和粘度关系的研究,证明正如它们的位置异构物2,6-TNS一样具有萤光疏水探针的性能。我们用此探针比较研究了胰岛素、去B链羧端五肽胰岛素(DPI)、牛血浆白蛋白、溶菌酶、卵白蛋白的疏水表面性质。结果表明DPI和胰岛素相似,存在一个小而确定的疏水区。提示B链羧端五肽的去除并未严重改变其与受体结合有关的疏水面结构。在生理pH值其疏水面暴露较胰岛素略大。但其疏水面构象稳定性较胰岛素弱,随pH升高,分子局部构象可能发生扭动,疏水面构象遭到一定程度的破坏。总的来讲,DPI结构较胰岛素松散,稳定性亦下降。     

利用~1H-NMR模拟谱研究二核苷酸A2′P(CH_3)5′A的构象性质

根据Altona等人的方法,在利用~1H-NMR模拟谱确定18℃、40℃、70℃三种温度下有关质子化学位移及偶合常数基础上,分析了A2′P(CH_3)5′A的两种非对映异构体(a)和(b)的构象状态。它们与A2′P(OH)5′A相比发现:(1)在18℃时两个核糖环是S型构象占主要成分,但随温度升高有的核糖环趋向于转化成N型构象;(2)磷酸骨架的扭角ε′和β分别改变±2°及±12°;(3)A2′P(CH_3)5′A(a)和(b)的两个核糖环均属部分重叠,并且前者的重叠程度小于后者;(4)随着温度升高,A2′P(CH_3)5′A(a)比A2′P(CH_3)5′A(b)有着更强的去堆积效应。