转座子相关技术在微生物功能基因组研究中的应用

转座子是DNA插入因子的一种,是指能在基因组间或组内跳跃的DNA片段。转座子作为插入突变剂或分子标签已被广泛地应用于基因的分离和克隆,且因其独特的性质已成为发现新基因和基因功能分析的有效工具。这使得转座子无论是在单基因水平还是全基因组水平,都成为细菌、酵母和其他微生物研究的有力工具。简单而有效的体外转座反应可以对一些以往难以进行分析的顽固微生物进行转座诱变分析。而建立在转座子基础上的信号标签诱变技术和遗传足迹法的应用则发现了一些新的病原微生物毒力因子,从而可以更好地对这些病原微生物的致病机理进行阐述。这些再次说明转座子是微生物功能基因组研究中的有力工具。本文综述了转座子及其衍生载体介导的一些技术,并讨论其在微生物功能基因组研究中的应用。     

昆虫中的mariner类转座子

转座子(transposon),是一种不依靠同源重组而能在基因组内移动的遗传学元件(DNA序列).它通过在基因组内的插入和割离,引起靶位点处DNA的缺失、重复或倒位重排,导致插入处基因突变或相邻基因表达活性的改变,是基因组不稳定性的主要内在因素之一,也是构成生物体生长、发育的遗传调控因子之一[1].     

转座因子IS10一个新的插入靶位点的序列分析

转座因子在生物体内广泛存在,它在研究基因的重组机理以及生物染色体的进化方面有着重要意义。IS10是细菌中的一种转座因子,它既能单独作为插入序列,也能作为Tn10的一部分进行转座。利用含sacB基因的质粒pXT3sacB,获得了由转座因子IS10插入而导致sacB基因失活的突变体。通过对插入突变体质粒DNA的序列测定（GenBank登记号为AY580883．1）,结果表明IS10两端分别包括22bp倒置重复区CTGAGAGATCCCCTCATAATTT和AAATCATTAGGGGATTCATCAG,这与前人的报道一致;而IS10两端的插入靶位点序列为TGCTTGGTT,该9bp靶位点序列与前人报道的序列NGCTNAGCN不同。根据文献资料,本研究中的靶位点序列是首次报道。此外,通过Southern blot杂交分析,插入sacB基因中的IS10来源于宿主大肠杆菌DH5α染色体DNA,并且IS10在DH5α染色体中为两个拷贝。此外,本研究利用sacB基因捕获到转座因子IS10,该方法为研究其他插入序列提供了一个有益的体系。     

切割DNA的新方法

<正> 在特殊位点切割 DNA,以分离特殊序列、插入新的遗传物质以及其它相似处理,这些都是重组 DNA 研究的精髓。一般情况下都需要限制性内切酶。现在,美国圣地亚哥 Salk 研究所找到一种在选择位点切割 DNA 不需要限制性内切酶的方法。概括地说,研究人员制备了与将要被切割的 DNA 以5′-末端互补的 DNA 短片段,这个制备的 DNA 短片段与大 DNA     

一种简单有效的克隆未知旁侧DNA片段的方法

操作含长插入片段的DNA克隆时 ,经常需要进行亚克隆和测序实验。通常的方法首先是得到插入片段的限制性内切酶谱 ,然后选择合适的内切酶消化DNA ,分离靶片段 ,将其连接入质粒载体中进行下一步操作。但这种方法工作量大 ,步骤繁琐。在此 ,介绍一种不需要做限制性内切酶谱分析 ,而根据靶片段的旁侧序列直接进行亚克隆实验的方法。首先 ,选择合适的限制性内切酶消化含长插入片段的DNA克隆 ,其中一种酶切在已知的旁侧序列上 ,另一为随机选择 ;然后酶切混合物与线性化的质粒载体连接 ,转化细菌得到一“亚克隆库” ;将其中的克隆挑选入 96孔板培养后 ,按行或列混合菌液得到相应的“pool” ;最后 ,用PCR方法筛选获得含靶DNA片段的阳性克隆 ,其中所用的引物一个与已知的旁侧DNA序列配对 ,另一个与质粒载体上序列配对 ,PCR扩增已知的旁侧DNA片段以鉴定阳性克隆。多次独立实验表明该方法简单有效 ,可广泛用于亚克隆和DNA步移实验     

转座子Tn233(CH)链霉素敏感突变种及其回变种的研究

转座子Tn233-1(CH)是Tn233(CH)的链霉素敏感突变种,比较了突变种质粒pBR322:: Tn233-1(CH)DNA和野生型质粒pBR322::Tn233(CH)DNA的EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ与PstI限制性内切酶图谱,结果表明Tn233-1(CH)中带链霉素抗性基因的限制片段H3上插入了一个约800bp长的IS因子,在这个插入的DNA片段上有一个PstI切点而没有EcoRⅠ、BamHⅠ及HindⅢ切点。 对链霉素抗性回变种的质粒DNA pBR322:: Tn233-1-R(CH)的限制图谱加以分析后表明,插入在H3限制性片段上的IS因子已经切除,但是限制片段E2与E3的长度发生了改变。此外,在限制片段E2上出现了一个新的IS插入片段,在这一插入片段上有一个HindⅢ与PstⅠ切点。我们对此突变与回变的机理进行了讨论。     

预防仔猪腹泻无抗性基因工程菌株的构建

以原来含热不稳定肠毒素B亚单位基因质粒DNA为载体,插入lacZ基因,构建了一个既能表达LT-B亚单位又能表达B-半乳糖苷酶的含四环索抗性基因的重组体。在该重组DNA的四环素抗性基因内再插入K 88粘附因子抗原基因,从而灭活了四环素抗性基因。经测定该重组体能表达LT－B和K88两种抗原,lacZ基因取代四环素抗性基因,成为良好筛选标记。所构建的重组质粒能稳定存在。     

第23届国际生物学奥林匹克竞赛试题实验1·分子生物学和细胞生物学

<正>本次实验需要完成以下任务:利用限制性核酸内切酶切割DNA片段,并进行基因作图。A部分确定是否已将人类DNA插入到了1个克隆质粒中(80分)。B部分确定DNA片段插入的方向(20分)。材料、仪器设备     

插入玉米Ds转座因子的水稻转化群体及其分子分析

转座子标签法是一种利用转座因子插入高等植物基因组中造成基因突变,然后通过分离转座因子插入的旁邻顺序,进而克隆出突变基因的策略。这种策略在高等植物功能基因组学的研究中是十分有用的。为此目的,将玉米的Ds因子及bar基因连接至载体pCAMBIA1300的T-DNA区域中,构建成重组Ti质粒pDsBar1300。pDsBar1300中T-DNA区域中的潮霉素抗性基因可在转化过程中用作水稻转化植株的选择标记。插入在Ds因子中的bar基因可追踪转化后代的Ds因子。pDsBar1300通过根瘤农杆茵介导引入水稻品种中花11号的幼胚组织。从各转化愈伤组织中获得了1400株独立的Ds水稻转化植株。通过PPT抗性检测和PCR分析证明了水稻转化植株中Ds因子的整合。Southernblot分析了转化植株基因组中Ds因子的插入拷贝数,其中单拷贝插入比率约占70％。这些插有Ds因子的水稻转化植株,当引入自主型的Ac因子反式活化Ds因子后,可使Ds因子跳跃到不同位点上,就可得到更多的突变植株。     

Whirly转录因子研究进展

Whirly蛋白是广泛存在于植物细胞内的一种转录因子。它既能与单链DNA结合,也能与RNA结合,无论在细胞核还是在质体内都有着广泛而复杂的生物学功能。本文概述了Whirly蛋白的结构、种类、分布及其作用机制,并重点讨论了其在细胞核及质体内的功能,最后对Whirly蛋白研究中需要解决的问题做了展望。     

内含子Ⅱ的作用机制和演化

内含子是广泛存在于原核生物的叶绿体、线粒体以及真核生物基因组中的非编码DNA序列,但其含有的调控元件却常常影响基因的表达效率。内含子的自我剪接在mRNA的成熟过程中起着重要作用,内含子也可利用逆转录剪接作用插入到同源或异源DNA中,同时也常常通过“外显子改组”来促进基因进化。文章重点介绍了近年来在内含子Ⅱ作用机制及演化方面研究的最新进展。     

高频度微卫星不稳定性大肠癌"修饰型"微卫星变化与MLH1及KRAS基因突变密切相关

本研究通过方法学的改良和观察方式的创新试图阐明这种现象的原因.微卫星非传统的检测方法仅能实现微卫星定性检测,我所在的研究组开发了自动片段分析双荧光标识技术,提高了微卫星检测的感度和重复性,并实现了微卫星片段变化长度的定量.小于6碱基的微卫星变化被定义为修饰型微卫星不稳定,大于8碱基的变化被定义为跳跃型微卫星不稳定,它们的电泳谱截然不同.前者表现为在非肿瘤来源微卫星位点基础上的增加或减少,后者表现为距离非肿瘤微卫星片段远隔部位的新波形的出现.通过研究我们发现,在DNA错配修复缺陷细胞系及基因敲除大鼠自发肿瘤样本,仅有修饰型微卫星不稳定性检出;在人类DNA错配修复缺陷细胞系连续80次传代也没有检出跳跃型变化.跳跃型变化不能通过简单重复序列不稳定基础上的增加或减少的累加而获得.在76例散发大肠癌,我们检测了微卫星不稳定性,KRAS基因突变,并对高频度微卫星不稳定性病例的两个主要DNA错配修复基因MSH2和MLHl进行了全长测序.我们发现,在大肠癌,按频度的传统分类与按波形变化的分类有高度的一致性,高频度微卫星不稳定性病例均检测到跳跃型表现,低频度微卫星不稳定性都表现为修饰型变化.在12例高频度微卫星不稳定病例,有三例检出了跳跃型和修饰型同时存在微卫星不稳定的特殊表型,这3例均检出KRAS的突变,更有趣的是该3例病例也同时检出了DNA错配修复基因MLH1的变异.而在其他9例高频度微卫星不稳定病例,KRAS突变及MLH1、MSH2交变未检出.通过对突变谱的分析我们还发现,修饰型微卫星不稳定与KTAS基因12号密码子的转换型突变高度相关,而微卫星稳定的病例检出的KRAS基因12号密码子突变多为颠换型突变.修饰型微卫星不稳定表型检出的高频度转换突变可由DNA错配修复缺陷的分子背景解释.通过本研究,我们认为以波形为基础的微卫星不稳定新分型可能是解决目前微卫星研究领域矛盾的一个选项.一直公认为高频度微卫星不稳定性是"真正"的DNA错配修复缺陷表型,我们的研究提示实际上高频度微卫星的可能是多元的.修饰型微卫星不稳定与DNA错配修复缺陷直接关联,而跳跃型微卫星不稳定的原因尚未阐明.在高频度为微型不稳定中,携带修饰型变化的病例可以通过DNA错配修复系统缺陷来解释其病因.     

大肠杆菌无痕重组的策略与应用

Red同源重组技术发展迅速,已经广泛应用于大肠杆菌基因的敲除、插入与替换。与传统的DNA有痕重组技术相比,基于Red重组原理的DNA无痕重组技术,能够更为精确、快速、高效地修饰大肠杆菌基因组中的目标基因,且在基因组中不残留任何外源片段,因此不会影响后续的基因操作与基因表达。从Red同源重组的原理出发,简要综述了近年来在大肠杆菌中广泛使用的无痕重组技术的原理及操作策略,并对比分析了各种方法的优势与不足;同时,还介绍了DNA无痕重组技术在大肠杆菌基因修饰中的应用情况。     

果蝇P转座因子的研究进展

果蝇P因子是DNA转座子,在近几十年里受到很大关注。可用于确认有关基因,克隆基因以及安置基因回到基因组。P因子的高易动性及其保持和对内部序列强烈的修饰作用也是P因子的本质特征。P因子的另一重要用途是用于产生转基因果蝇。目的基因置于质粒内P因子中可在转座酶的作用下插入前胚盘胚。携带目的基因的P因子可从质粒转座到任意染色体上。据报道,在典型实验中,插入可育果蝇的10％～20％可产生转化体后裔。但是以这种可动DNA片段作为载体尚存在转移基因的不稳定性及与内源跳跃基因的相互影响。本文介绍了果蝇P转座因子的一些研究进展。这些因子的遗传可动性也使它们适用于建造载体产生转基因生物。若如此,载体导入外源基因组的遗传稳定性问题将是一个重要课题。 Abstract：P elements in D.melanogaster are DNA transposons and received greater attention within the last few decades.P elements are used for identifying genes of interest,for cloning them,and for placing them back into the genome.The high mobility of P elements and their retention of this mobility and drastic modiffications to their internal sequences are also essential features.Another most important use of P elements is that of making transgenic flies.Desired gene is placed between P-element ends,usually within a plasmid,and injected into preblastoderm embryos in the presence of transposase.This P element then transposes from the plasmid to a random chromosomal site.Reported in a typical experiment,10％～20％ of the fertile injected flies produce transformant progeny.But the instability of the transferred gene carried on a piece of mobile DNA as a vector and its interaction with endogenous jumping genes.This paper introduced the studies advances of P transposable element in Drosophila.The genetic mobility of these elements can also make them suitable for the construction of vectors to create transgenic organisms.If so,the genetic stability of the vectors introduced to a foreign genome should be a important subject.     

白细胞介素－2活化DNA结合因子的研究

用凝胶阻滞分析的方法, 发现鼠T淋巴细胞系CTLL-2在白细胞介素-2(IL-2)刺激下可活化一个DNA结合因子, 它与γ-干扰素活化序列(GAS)专一性结合, 命名这个DNA结合因子为白细胞介素-2活化核因子(IL-2-NAF).IL-2-NAF的活化非常迅速, 不需要新的蛋白质合成, 并且它的活化程度随着IL-2刺激细胞的时间的不同而发生相应的变化. 进一步研究表明, IL-2-NAF的活化过程是通过酪氨酸激酶的信号传递途径, 并且它本身的酪氨酸残基也被磷酸化, 酪氨酸残基的磷酸化为其结合DNA所必需. IL-4、γ-IFN刺激CTLL-2细胞不活化与GAS专一性结合的因子. 而在Hut-102细胞中, IL-2、IL-4均可活化GAS结合因子, 但活化程度较弱.     

利用高效的大片段DNA回收方法改良Fosmid文库的构建

外源DNA插入片段为40 kb左右的Fosmid文库在基因组学研究中有广泛的应用,但长期以来,40 kb外源片段的分离与纯化依赖于传统的切胶并电洗脱至透析袋的方法,难以得到足够量的DNA片段,极大降低Fosmid文库构建的成功率。通过改进全自动核酸/蛋白质回收系统SageELF的操作流程,建立一种简单、便捷、高效地回收40 kb左右DNA片段的方法,并用其成功地构建高质量的Fosmid文库。从文库中随机挑选的25个单克隆,经过测序及酶切分析,发现该文库中插入的DNA片段大小为37.9±5.2 kb。以上结果表明,利用改良的操作方法回收40 kb基因组DNA,操作简捷、高效,片段大小精准;另外,用该DNA片段构建的Fosmid文库,插入片段比较集中,有利于后续的基因组学分析。     

拟南芥复制因子C亚基1在胚胎发生中起重要作用

复制因子C包含1个大亚基和4个小亚基,在DNA复制、损伤修复和细胞增殖中起重要作用,拟南芥复制因子C亚基1(AtRFC1)是人类复制因子C大亚基p140的同源蛋白。在对3个复制因子C亚基1的T-DNA插入突变株系rfc1-1、rfc1-2和rfc1-3的检验中,证实插入位点分别位于第16、19号外显子和启动子区域。T-DNA在外显子中的插入突变引起胚胎发育异常并导致胚胎和种子败育。将野生型拟南芥复制因子C亚基1基因转化到突变株系rfc1-1和rfc1-2后恢复了突变株的野生型表型,证明胚胎发生异常表型是由拟南芥复制因子C亚基1基因突变所引起的,AtRFC1在拟南芥胚胎发生中起重要作用。     

Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性及转座子插入位点旁侧序列的分析

利用本实验室构建的转Ac(AcTPase)及Ds(Dissociation)的水稻(Oryza sativa L.)转化群体,配置了Ac×Ds的杂交组合354个.检测了转基因植株的T-DNA插入位点右侧旁邻序列,研究了Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性.结果表明,有些转化植株T-DNA插入位点相同或相距很近,插入位点互不相同的占65.4%.检测到T-DNA可插入到编码蛋白的基因中.在Ac×Ds的F2代中,Ds因子的转座频率为22.7%.对Ac×Ds杂交子代中Ds因子旁侧序列的分析,进一步表明了Ds因子在水稻基因组中的转座活性,除了从原插入位点解离并转座到新的位点之外,还有复制--转座和不完全切离等现象.获得的旁侧序列中,有些序列与GenBank中的数据没有同源性,目前有2个DNA片段在GenBank登录.探讨了构建转座子水稻突变体库进行水稻功能基因组学研究的策略.     

插入含Ds因子的T-DNA产生的水稻脆秆突变株的遗传和分子分析

在构建由农杆菌介导的玉米Ds转座因子插入的水稻转化群体中,得到了一个茎秆等组织发生脆性突变的株系。理化指标定量测定表明,脆性株系的载荷强度和纤维素含量都比正常植株低很多,可溶性糖含量略有减少。对这个突变株的分子检测结果表明Ds因子在脆性株系中为单位点插入。检测了自前3代（T1,T2,T3)植株中T-DNA(Ds)插入与脆性表型的共分离关系。初步结果表明这个突变是T－DNA（Ds)的插入造成的,这个突变基因可能与水稻纤维素合成有关。     

一种基于核酸外切酶Ⅲ的PCR产物克隆方法

基因克隆作为一种常规技术被广泛应用于DNA及蛋白质的研究。在传统的基因克隆中,一般利用限制性内切酶对DNA片段进行消化,然后使用DNA连接酶完成连接,因此这种方法受到插入片段和载体酶切位点的限制。一些ligase-free克隆技术虽然克服了酶切位点的限制,但费时费力,成本较高。为了弥补其他ligase-free技术的不足,文中介绍了一种新的利用核酸外切酶Ⅲ进行ligase-free克隆的方法,反应时间仅需要30 min,提高了克隆效率并有效降低经济成本,有利于大规模基因克隆的应用。