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1.
利用聚合酶链式反应 (PCR)获得了萝卜 (RaphanussativusL .)抗真菌蛋白 1(Rs_AFP1)基因编码区核苷酸序列。将整个阅读框架片段和去除了N_端信号肽序列的片段分别装入原核表达载体pET_32b( )中 ,在大肠杆菌中表达 ,发现带有信号肽的Rs_AFP1不能在大肠杆菌中表达 ,而当这一序列去除后 ,表达出约 2 7kD的Rs_AFP1的融合蛋白。用凝血酶处理融合蛋白以去除N_端His.tag的部分序列 ,然后用处理后的融合蛋白进行了抑制真菌生长的实验。结果表明 ,在加入 0 .3g/L的Rs_AFP1的融合蛋白的培养液中 ,大丽轮枝菌 (VerticilliumdahliaeKleb .)的生长受到抑制 ,分别比加入对照细菌蛋白和PBS下降 5 7.5 %和 6 9.8% ;孢子的萌发也受到抑制。显然 ,细菌表达的融合蛋白对大丽轮枝菌的生长有抑制作用。 相似文献
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鉴于Flt-1有肿瘤及其他由于病理血管生成而导致的多种疾病中的核心作用,本文通过PCR扩增出的VEGF受体Flt-1N端1-3个IgG样loop基因,经过基因重组实现了Flt-1在原核表达体系5X-1的融合表达。 相似文献
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抗真菌蛋白Rs—AFPs基因在大肠杆菌中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
将抗真菌蛋白Rs-AFP1和Rs-AFP2全长cDNA插入表达质粒pET-22b/NcoI+SacI位点,构建成融合蛋白表达载体pRAF1和pRAF2.将不含信号肽编码序列的Rs-AFP1和Rs-AFP2cDNA分别插入pET-22b/Ncol+Sacl和pET-22b/Ndel+SacI位点,构建成不含信号肽序列的融合蛋白表达载体pRAF3、pRAF4和非融合蛋白表达载体pRAF5和pRAF6.将构建的上述各种表达载体转化E.coliBL21,挑菌落培养,IPTG诱导,使Rs-AFPs基因得到表达,并用体外抑菌试验检测表达产物的活性,结果表明,各种表达载体的表达产物均具有不同程度的抑菌活性,其中,pRAF3和pRAF4表达产物的抑菌活性较明显. 相似文献
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噬菌体T7溶菌酶及其融合蛋白在大肠杆菌中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
以噬菌体T7DNA为模板,PCR扩增T7溶菌酶基因,插入pBluescriptSK载体中,DNA序列分析表明,克隆的T7溶菌酶基因和已报道的序列无氨基酸水平上的差异。将T7溶菌酶基因分别拼接在烟草病原相关蛋白(PR1b)信号肽编码序列的3’末端和马铃薯卷叶病毒外壳蛋白(PLRVCP)基因靠近3’末端处,构建成两个融合蛋白基因。将T7溶菌酶及其融合蛋白基因插入大肠杆菌表达载体pBV221,蛋白电泳及溶菌实验表明,T7溶菌酶基因在大肠杆菌中高效表达,其产物的表达量占菌体可溶性蛋白的20%以上,PLRVCP的表达量并没有因C端融合T7溶菌酶而提高,高等植物的信号肽在大肠杆菌中也能起分泌信号作用。 相似文献
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萝卜抗真菌蛋白1(Rs-AFP1)在大肠杆菌中的融合表达
及其对大丽轮枝菌抑制活性的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
ZHOU Xiang-Jun WANG Lun-Shan LIN Zhi-Ping JIA Jun-Wei LU Shan CHU Zhao-Qing CHEN Xiao-Ya 《植物学报(英文版)》2000,42(7):703-707
The Raphanus sativus L. antifungal protein 1 (Rs-AFP1) gene was isolated by polymerase chain reaction (PCR). The complete open reading frame and the fragment encoding the putative mature protein were inserted into the prokaryotic expression vector pET-32b(+), respectively. Subsequent expression showed that the Rs-AFP1 was produced in E. coli as a 27 kD fusion protein only when the N-terminal signal peptide was removed. After treatment with thrombin to remove part of the N-terminal His.tag sequence, the bacterially expressed Rs-AFP1 was used for fungal growth inhibition assay which was conducted on Verticillium dahliae Kleb., a soil-born fungus causing the cotton wilt disease. Results showed that, in the liquid medium, the Rs-AFP1 fusion protein at a concentration of 0.3 g/L clearly inhibited the growth of V. dahliae and the germination of spores. Thus the bacterially expressed fusion protein had the antifungal activity against V. dahliae. 相似文献
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将HIV-1MA4-CA融合基因克隆到高效表达载体pBV220中,将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达。收集细菌,菌体裂解后进行SDS—PAGE检测。结果表明,成功地构建了含MA4-CA融合基因的表达载体pBV220-MA4-CA,该载体能在大肠杆菌中表达相对分子质量为16000并以包涵体形式存在的融合蛋白,此蛋白经洗涤后能够溶于8mol/L的尿素中。利用硫酸铵沉淀法进行初步纯化后即可得到纯度比较高的MA4-CA融合蛋白,为今后进一步的功能和应用研究打下了良好的基础。 相似文献
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人类免疫缺陷病毒1型(HIV—1)核心蛋白(p24)在大肠杆菌中的表达,纯化… 总被引:2,自引:0,他引:2
在大肠杆菌中,利用新构建的含T7噬菌体g-10核糖体结合位点(RBS),以及λ噬菌体PR启动子的新型原核表达载体,通过表达gag-pol基因片段,获得了具有天然序更的人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核心蛋白P24(CA)的高效表达,克隆的gag-pol基因片段 在其阅读框架移位区域插入了4bp碱基,其的病毒蛋白酶在阅读框架上与gag一致,从而实现了对gag-pol融合蛋白有有效加工,产生成熟的核 相似文献
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高毒力大丽轮枝菌特异片段SCF73突变株的构建及其致病力测定 总被引:1,自引:0,他引:1
[目的]初步明确高毒菌株VDG1特异片段SCF73与大丽轮枝菌致病力的关系.[方法]通过比较基因组学分析和PCR鉴定,明确大丽轮枝菌高毒菌株VDG1相对于低毒菌株VDG2的特异片段SCF73 ;构建SCF73片段敲除质粒,导入农杆菌AGL-1,应用农杆菌介导法转化大丽轮枝菌VDG1,抗性筛选和PCR扩增鉴定SCF73敲除转化子 ;利用果胶、纤维素和淀粉培养基模拟分析ΔSCF73降解细胞壁组分的能力,采用定量蘸根接种法鉴定其对感病棉种军棉1号的致病力.[结果]确定了大丽轮枝菌VDG1的特异片段SCF73,长度为27.1 kb,预测编码5个基因,推测2个基因具有水解酶功能 ;筛选获得了3个ΔSCF73突变株 ;突变株利用细胞壁组分的能力与野生型菌株VDG1相比无显著差异 ;突变株对感病棉种军棉1号的致病力显著减弱.[结论]高毒力菌株VDG1特异片段SCF73在大丽轮枝菌致病过程中具有重要作用. 相似文献
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以融合蛋白形式在大肠杆菌中表达人MCP—1 总被引:2,自引:0,他引:2
将编码人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pEX31A中,在大肠杆菌中表达出MS2/MCP-1融合蛋白,该表达产物约占菌体总蛋白的15%左右,Western blot检测表明,表达产物可与MCP-1抗体特异反应,采用琼脂糖平板法进行活性测定表明,表达产物具有明显的单核细胞趋化活性,说明N端融合一段细菌蛋白对MCP-1有无趋化活性可能没有影响。 相似文献
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HIV—1Gag蛋白在大肠杆菌和重组杆状病毒系统中的高效表达及通用型 … 总被引:1,自引:0,他引:1
将中国株HIV-1B亚型gag全基因序列,克隆杆状病毒表达载体pfastbacI中,构建了重组质粒pfastGag,利用细菌/杆状病毒表达和筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞中高效表达HIV-1Gag蛋白。通过改造原核表达载体pBV220和pET28,构建了一种新的通用型温控原核表达载体质粒pVV5,该载体携带PrPl串联温控启动子及His-Tag纯化标签,利于目的的蛋白表达与纯化。 相似文献
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重组人融合基因Nm23—H1/HbFGF的构建及其在大肠杆菌中表达?… 总被引:1,自引:0,他引:1
根据Nm23-H1与HbFGFcDNA序列,人工合成一段中间核酸序列,将它分别与Nm23-H1cDNA的上游引物及HbFGFcDNA的下游引物组成两对引物,通过PCR(聚合酶链式反应)构建出融合基因Nm23-H1/HbFGF,将其定向克隆于质粒载体pBV220上,经诱导,SDS-PAGE分析,表达产物分子量为34kD,表达量占菌体总蛋白的14%,表达产物以包涵体形式存在,ELISA和Western 相似文献
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重组BPI23—Fcγ1融合蛋白在CHO细胞中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
The fusion gene of BPI23 and human Fc gamma 1 was obtained by PCR method, and the expression plasmid was constructed to express recombinant BPI23-Fc gamma 1 fusion protein in CHO cells. After transfection with the plasmid and selection by methotrexate, the cell lines expressing the fusion protein were obtained. The recombinant protein was purified using cation-exchange chromatography and its bioactivity was proved with bactericidal assays. 相似文献
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将编码人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pEX31A中,在大肠杆菌中表达出MS2/MCP-1融合蛋0白,该表达产物约占菌体总蛋白的15%左右,Westernblot检测表明,表达产物可与MCP-1抗体特异反应。采用琼脂糖平板法进行活性测定表明,表达产物具有明显的单核细胞趋化活性,说明N端融合一段细菌蛋白对MCP-1有无趋化活性可能没有影响。 相似文献
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高效大丽轮枝菌(Verticillium dahliae) 基因敲除体系的构建 总被引:2,自引:0,他引:2
[目的]为了深入研究大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)致病基因的功能,构建高效大丽轮枝菌基因敲除体系.[方法]融合PCR构建基因敲除载体;利用农杆菌介导法转化大丽轮枝菌;使用在T-DNA之间加入致死基因的双元载体,使T-DNA随机插入转化子在添加5-氟脱氧尿苷的培养基上不能存活,实现对随机插入转化子的"反向筛选".[结果]对大丽轮枝菌腺嘌呤合成酶基因和几丁质合成酶基因进行基因敲除验证,基因敲除转化子在总转化子中的比例分别达到87%和44%.[结论]成功构建大丽轮枝菌高效基因敲除体系,为大丽轮枝菌致病基因的功能验证提供了技术平台. 相似文献
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高效融合表达中载体蛋白对hIGF—I免疫原性结构形成的… 总被引:3,自引:0,他引:3
利用人工全合成人胰岛素样生长因子I(hIGF-I)基因,构建了分别以β-半乳糖苷酶的三种即含590、310、280个氨基酸序列片段和一种以Protein A、C结构域为载体蛋白的融合型表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了以上各种hIGF-I的融合蛋白产物。通过对羟胺裂解前后的hIGF-I产物进行放射免疫结合测定分析;结果显示以β-Gal590、310、280为载体蛋白;均严重影响与其融合的hIGF- 相似文献
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萝卜抗真菌蛋白1(Rs-AFP1)在大肠杆菌中的融合表达及其对大丽轮枝菌抑制活性的研究(英) 总被引:1,自引:0,他引:1
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为了更加快捷地筛选大丽轮枝菌致病关键基因,利用聚乙二醇介导的原生质体转化法构建病原菌随机插入突变体库,对部分阳性转化子的生长表型指标和致病力进行分析,筛选生长发育与致病缺陷突变体并进行靶标基因定位。结果表明,本研究共获得13 030多个阳性转化子,随机挑选5个转化子与V991野生型菌株进行比较分析,发现其中一个突变体在PDA和不同碳源培养基上的菌落直径、产孢量以及致病力均显著降低。侧翼序列测序结果结合Blast比对分析表明,该缺陷突变体中的潮霉素抗性基因表达盒定位于大丽轮枝菌3号染色体1 528 782 bp处,属于内切葡聚糖酶1基因(VDAG_04017)。综上所述,本研究通过大丽轮枝菌插入突变体库构建、突变体生长表型指标和致病力鉴定及靶标基因定位等一系列分子生物学手段,可初步鉴定病原菌致病相关基因,为从全基因组层面深入研究大丽轮枝菌致病机制奠定了一定基础。 相似文献
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Trx-NAP 5融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其活性检测 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:用大肠杆菌表达获得重组线虫抗凝血肽5(rNAP 5),为研究开发NAP5的功能与应用提供原料来源。方法:将扩增的NAP5基因经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后与表达载体pET-32a连接。构建好的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,分别经IPTG和乳糖诱导表达,并探讨诱导表达条件,分析表达产物的可溶性情况。表达产物经镍亲和纯化后,用凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)检测体外抗凝活性。结果:成功构建了pET-32a/NAP5表达载体,IPTG和乳糖均能诱导目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地可溶性表达。优化条件下每升LB培养基可获可溶性目的融合蛋白量达65.3mg。纯化的蛋白能明显延长PT及aPTT,7.0mg/L的蛋白平均约延长5.09倍aPTT,2.55倍PT。结论:在大肠杆菌中成功表达了具有很好生物活性的Trx-NAP5融合蛋白,为研究开发NAP5的功能与应用奠定了基础。 相似文献