布洛芬微生物降解研究进展

布洛芬是苯丙酸类非甾体类抗炎药物的典型代表,属于重要的药物及个人护理品类物质。大量生产和广泛使用的布洛芬在为人类减轻病痛的同时,也带来诸多环境污染危害,已经成为重要潜在环境污染物之一。本文简要介绍布洛芬的使用情况和环境中布洛芬残留的潜在风险,重点总结布洛芬的微生物降解及降解机理研究,提出应当关注污水、脱水污泥、河流沉积物和湿地中布洛芬的微生物降解,强调开展布洛芬降解基因克隆和功能分析以及从分子水平阐明布洛芬降解机理研究的必要性及紧迫性。     

壳聚糖-海藻酸钠微胶囊对布洛芬的缓释作用

布洛芬作为非甾体抗炎药中的典型代表,具有较好的解热镇痛抗炎作用。但由于其具有胃肠道刺激性、首关效应等缺陷,使用普通制剂很难达到较为理想的临床效果。将壳聚糖-海藻酸钠微胶囊作为载体对布洛芬进行缓释实验,实验结果显示该类微胶囊对布洛芬具有较好的缓释作用,且包封率达到了9 2%。在本文中,将就壳聚糖-海藻酸钠纳米微胶囊对布洛芬的缓释作用进行阐述。     

手性高效液相色谱法测定S(+)-布洛芬对映体过量

用手性固定相高效液相色谱法(CSP-HPLC)测定了样品或微生物酶不对称水解反应液中S(+)-布洛芬对映体过量(ee)。该法首先将布洛芬转化为二苯酰胺衍生物,然后在N-3,5-二硝基苯甲酰-?-苯甘氨酸[?-DNB-PG]的共价型CSP柱上进行对映体HPLC分离。流动相选择正已烷-异丙醇(98:2),流速1ml/min,对映体分离度1.47。按相同方法同时进行消旋布洛芬的二苯酰胺衍生物的分离,由其对映体峰高比可测定S(+)-布洛芬ee(%)。测定加量回收率相对标准偏差为3.3%。     

用薄层色谱扫描法测定微生物酶反应液中的布洛芬

用薄层色谱扫描法(TLCS)测定由微生物酶立体选择性水解布洛芬消旋酯生成布洛芬的转化率。酶水解的反应液经酸化处理后用正己烷提取,在硅胶薄层板上用甲苯-乙酸乙酯-乙酸(70:30:1.5)上行展开,然后对布洛芬斑点进行原位吸光度扫描,测定波长212nm,以外标二点法面积校正定量。本法在测定布洛芬量2—6μg范围内,响应呈现良好的线性关系。测定水解反应液转化率的最大相对标准偏差小于4%,加量回收率为97.4—101.0%。     

过渡金属催化手性α-取代丙酸类药物的不对称氢化合成进展

手性α-取代丙酸及其衍生物是一类重要的有机合成彻块和关键中间体,现已被广泛地应用于手性药物的合成之中。如临床正在大量使用的非甾体类抗炎药布洛芬、萘普生、酮洛芬和氟比洛芬等。众所周知的抗疟药青蒿素,其合成关键中间体二氢青蒿酸同样属于此种结构。所以,手性α-取代丙酸及其衍生物的不对称合成一直是科学家研究的热点。不对称催化氢化反应因为其原子经济性和高效性,越来越引起人们的关注。本文主要综述了近年来过渡态金属催化氢化合成手性α-取代丙酸类药物的研究进展。     

微生物酶不对称水解合成S(+)-布洛芬的研究 Ⅰ.高度立体选择性菌株的筛选

从361株细菌和酵母菌中分别筛选到12株可不对称水解布洛芬乙酯生成R(-)-布洛芬的细菌(5株菌对映体过量(ee)可达85%)和15株具有不对称水解布洛芬乙酯活性的酵母菌,其中皮状丝孢酵母T158生成S( )-布洛芬,ee可超过92%.该酵母菌最适碳源为葡萄糖,浓度以1.0—1.5%适宜,蛋白胨浓度低于0.3%或高于0.5%对水解拆分均不利.酵母膏的加入显著提高水解活性,最适浓度0.3%.在培养基中添加表面活性剂吐温80(0.2%)既可提高拆分专一性,又能增强水解能力.     

微生物酶不对称水解合成S(+)-布洛芬的研究 Ⅰ.高度立体选择性菌株的筛选

从361株细菌和酵母菌中分别筛选到12株可不对称水解布洛芬乙酯生成R(-)-布洛芬的细菌(5株菌对映体过量(ee)可达85%)和15株具有不对称水解布洛芬乙酯活性的酵母菌,其中皮状丝孢酵母T158生成S(+)-布洛芬,ee可超过92%.该酵母菌最适碳源为葡萄糖,浓度以1.0—1.5%适宜,蛋白胨浓度低于0.3%或高于0.5%对水解拆分均不利.酵母膏的加入显著提高水解活性,最适浓度0.3%.在培养基中添加表面活性剂吐温80(0.2%)既可提高拆分专一性,又能增强水解能力.     

布洛芬喷雾剂药效学研究

目的:对布洛芬喷雾剂与布洛芬片剂进行药效学比较。方法:应用布洛芬喷雾剂和布洛芬片剂观察对小鼠的镇痛作用。结果:布洛芬喷雾剂的镇痛作用比布洛芬片剂起效更快,作用更强。结论:布洛芬喷雾剂药效比布洛芬片剂好。     

微生物酶不对称水解合成S(+)-布洛芬的研究 Ⅰ.高度立体选择性菌株的筛选

从361株细菌和酵母菌中分别筛选到12株可不对称水解布洛芬乙酯生成R(-)-布洛芬的细菌(5株菌对映体过量(ee)可达85%)和15株具有不对称水解布洛芬乙酯活性的酵母菌,其中皮状丝孢酵母T158生成S(+)-布洛芬,ee可超过92%.该酵母菌最适碳源为葡萄糖,浓度以1.0—1.5%适宜,蛋白胨浓度低于0.3%或高于0.5%对水解拆分均不利.酵母膏的加入显著提高水解活性,最适浓度0.3%.在培养基中添加表面活性剂吐温80(0.2%)既可提高拆分专一性,又能增强水解能力.     

右布洛芬脂肪乳注射液的分析方法及处方筛选

为研究右布洛芬脂肪乳注射液并建立分析方法,对右布洛芬原料药稳定性及原辅料相容性等进行研究以筛选处方。建立了一种反相高效液相色谱法,可测定右布洛芬含量及杂质。通过高温、高湿、强光照条件考察原料药及原辅料混合物的有关物质特性。制备含15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯(Kolliphor HS 15)不同浓度的右布洛芬脂肪乳注射液,考察剂型的质量。结果发现:线性范围为2.0～50.0μg/mL(R~2=0.999 9);原料药对热不稳定,原辅料混合物有关物质均小于1.0%;含Kolliphor HS 15 0.5%的右布洛芬脂肪乳注射液溶液稳定,有关物质小于1.0%。本研究不仅建立了适用于右布洛芬测定的分析方法,还确认了右布洛芬与所选择辅料无配伍禁忌,筛选的处方可满足质量要求,为产品进一步研究提供了数据支持。     

拆分获得(S)-酮基布洛芬脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆与表达

【目的】筛选具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的脂肪酶基因,构建其表达分泌型工程菌,并进一步提高该脂肪酶的立体选择性。【方法】以自筛选出的一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的菌株NK13为材料,通过构建其基因组文库,筛选具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的脂肪酶基因。通过构建该脂肪酶基因的分泌型诱导表达载体pHY300-plk-sacR-gene,将其转入枯草芽孢杆菌WB600,获得基因重组菌WB600(pHY300-plk-sacR-gene)。用SDS-PAGE检测其表达和转化情况,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法纯化脂肪酶;并利用TLC和HPLC检测该酶的立体选择专一性。【结果】得到了具有专一性拆分获得(S)-酮基布洛芬能力、长度为633bp的脂肪酶基因(GenBank登录号为:EU381317)。该脂肪酶在枯草芽孢杆菌WB600中得到了分泌表达。TLC和HPLC检测结果显示,纯化的脂肪酶对底物转化40h时转化率为30%,生成(S)-酮基布洛芬的e.e.%值最高,达60.02%,与未加Tween-80的枯草芽孢杆菌转化子体系相同。而在含Tween-80的环境下,枯草芽孢杆菌表达重组菌对底物转化36h时转化率约为45%,生成(S)-酮基布洛芬的e.e.%值最高,达93.64%,是野生菌NK13的16倍。【结论】从NK13号菌株中筛选得到的新的脂肪酶具有很高的不对称拆分获得(S)-酮基布洛芬的能力,实现了NK13菌中633bp脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,研究证明Tween-80能提高该脂肪酶的拆分专一性。     

微生物酶不对称水解合成S(+)-布洛芬的研究 Ⅱ.反应条件和产物提取

皮状丝孢酵母具有较强不对称水解底物专一性.在试验的五种布洛芬消旋酯中,水解甲酯和异丙酯生成s(+)-布洛芬ee可达97%,乙酯为93%以上;而水解活性以乙酯最强,转化率高于30%.不对称水解最适pH6.5—7.0;温度在28—37℃范围内拆分能力无明显差别.该酵母的水解酶为胞内酶,将酵母细胞制成两酮干粉进行水解可提高立体专一性.产物S(+)-布洛芬可借助于酸碱反应和有机溶剂提取得到,同时回收未水解的酯.     

布洛芬对肝癌细胞HepG2增殖及wnt／β-catenin信号通路的影响

研究非甾类抗炎药布洛芬对肝癌细胞增殖和β-catenin信号通路的影响,探讨布洛芬影响肝癌细胞增殖的可能机制.体外培养HepG2细胞,MTT法检测不同浓度布洛芬分别作用24、48和96 h后细胞增殖情况;应用RT-PCR检测布洛芬处理HepG2 48 h后β-catenin、cyclin D1和c-myc转录水平的变化;western blotting检测布洛芬对HepG2中β-catenin1蛋白表达量的影响;免疫细胞化学法观察布洛芬处理组HepG2细胞β-catenin的亚细胞定位.结果表明0.7mmol/L的布洛芬处理细胞48 h后能明显见到细胞增殖受到抑制,抑制率达到53.8%,且抑制作用有时间、剂量依赖性:经布洛芬处理后细胞的β-catenin、cychn D1和c-myc转录也受到显著抑制;布洛芬处理组细胞β-catenin蛋白表达低于对照组;布洛芬处理后β-catenin在胞核中定位减少,胞浆定位增多.因此,布洛芬能抑制肝癌细胞的增殖,且随着处理时间和药物浓度的增加,其抑制作用逐渐增强,其抑制作用可能与调控β-catenin信号通路,影响β-catenin的表达和定位,调节下游相关靶基因的转录有关.     

布洛芬对曲霉的体外抗真菌活性评价

目的观察布洛芬对曲霉临床分离株的体外抗真菌活性。方法分别用微量液基稀释法和纸片扩散法,测定布洛芬对10株烟曲霉、黄曲霉和土曲霉的抗菌活性。结果微量液基稀释法显示布洛芬对曲霉的最低抑菌浓度（MIC）范围为1000～2000μg/mL,最低杀菌浓度（MFC）范围为2000～8000μg/mL;纸片扩散法也显示布洛芬有体外抗曲霉活性：48h时,1000μg布洛芬对曲霉产生的抑菌圈直径为（20.1±3.89）mm。结论布洛芬有体外抗曲霉活性。     

耳尖放血配合布洛芬治疗儿童外感发热的疗效观察

目的观察耳尖放血配合布洛芬治疗儿童外感发热的临床疗效。方法将60例符合入选标准的外感发热患儿随机分为治疗组和对照组,每组各30例。治疗组采用耳尖放血配合布洛芬治疗,对照组单用布洛芬治疗,观察治疗后2h退热效果及随访24h复发率。结果耳尖放血配合布洛芬比单用布洛芬在治疗后2h的退热效果更佳（P〈0.05）,24h复发率也更低（P〈0.05）。结论耳尖放血配合布洛芬治疗儿童外感发热,退热效果好,复发率低。     

不同藻密度下布洛芬浓度对萼花臂尾轮虫生命表统计学参数的影响

在不同斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)密度(1.0×10~6、2.0×10~6个细胞/m L和4.0×10~6个细胞/m L)下,研究了不同浓度的(0、1、10、100、1000μg/L和5000μg/L)布洛芬对萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus)生命表统计学参数的影响。结果表明,与各藻密度下的对照组相比,当藻密度为1.0×106个细胞/m L时,100—5000μg/L布洛芬处理组中轮虫的生命期望和平均寿命显著缩短,100μg/L布洛芬处理组中轮虫的世代时间显著缩短,1.0μg/L布洛芬处理组中轮虫的净生殖率显著提高,10—5000μg/L布洛芬处理组中轮虫的后代混交率显著提高。当藻密度为2.0×10~6个细胞/mL时,10—5000μg/L布洛芬处理组中轮虫的生命期望和平均寿命显著缩短,1000μg/L和5000μg/L布洛芬处理组中轮虫的世代时间显著缩短,1、10、1000μg/L和5000μg/L布洛芬处理组中轮虫的种群内禀增长率显著提高,1μg/L和1000μg/L布洛芬处理组中轮虫的后代混交率显著提高。当藻密度为4.0×10~6个细胞/mL时,10—5000μg/L布洛芬处理组中轮虫的生命期望、平均寿命和世代时间显著缩短。藻密度对轮虫的世代时间、净生殖率和种群内禀增长率有显著性影响(P0.05),布洛芬浓度对轮虫的生命期望、平均寿命、世代时间、净生殖率和种群内禀增长率有显著性影响(P0.05),藻密度和布洛芬浓度的交互作用对轮虫的生命期望、平均寿命和后代混交率有显著性影响(P0.05)。在实验设置的布洛芬浓度范围内,2.0×10~6个细胞/m L藻密度下,轮虫的生命期望、平均寿命和世代时间与布洛芬浓度之间均具有显著的剂量—效应关系(P0.05); 4.0×10~6个细胞/m L藻密度下,轮虫的生命期望、平均寿命和净生殖率与布洛芬浓度之间均具有显著的剂量—效应关系(P0.05)。     

(S)-酮基布洛芬拆分用脂肪酶基因的克隆及表达

本实验室筛选出一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯的菌株NK13为材料,经鉴定为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium。通过构建其基因文库,从中筛选得到阳性克隆重组子pUC-NK1。测序分析表明,该重组子质粒中包含一长度为633bp的脂肪酶基因的完整开放阅读框,核苷酸同源性对比证明该脂肪酶基因属首次发现(GenBank Accession No.EU381317),将此基因克隆到原核表达载体pET21b(+)中构建重组表达质粒pET-NKest1,转化Escherichia coli BL21,经Isopropyl-β-D-Thiogalactoside(IPTG)诱导在宿主菌中得到表达,经SDS-PAGE电泳检测证明该脂肪酶成熟蛋白分子量约为20kDa。薄层层析与HPLC检测结果显示,表达菌株转化外消旋酮基布洛芬氯乙酯得到(S)-酮基布洛芬过量(e.e.%),由野生菌NK13的5.84%提高到75.28%,提高约15倍,说明该脂肪酶具有优先拆分得到(S)-酮基布洛芬的特性。     

多能干细胞诱导分化为肾脏类器官的分子机制及应用前景分析

干细胞具有自我更新和多向分化潜能,在再生医学领域发挥着越来越大的作用。肾脏类器官是一种由干细胞分化而来具有一定肾脏功能的组织结构,可用于肾脏疾病的细胞修复治疗,也可以模拟肾脏发育和疾病发生及用于筛选改善肾功能的药物。肾脏类器官的体外培育成为了当前研究热点,其体外培育可分为几个阶段：干细胞-原始体节中胚层-中间中胚层-输尿管芽（后肾间质）-集合管（肾单位）。本文重点介绍了目前两种较为成熟的肾脏类器官体外诱导方法,并对肾脏类器官的应用前景进行了综述。     

金黄色葡萄球菌耐药性分析

目的 分析金黄色葡萄球菌的耐药性。方法 对临床各科室送检标本,用MicroScan全自动细菌鉴定仪鉴定细菌种类并检测该菌对抗生素的敏感性。结果 检出金黄色葡萄球菌378株,其中MRSA为197株,检出率为52.1%.MSSA对苯唑西林,阿莫西林-棒酸,第1、2、3代头孢菌素等β-内酰胺类以及喹诺酮类、氨基糖苷类均甚敏感。MRSA对万古霉素敏感,未检出对万古霉素耐药或敏感性降低的菌株。对利福平、呋喃妥因有较好的敏感性.而对β-内酰胺类青霉素、苯唑西林和氨苄西林是100%的耐药,对头孢类抗生索、氟喹诺酮、大环内酯类及氨基糖苷类药物耐药率高。结论 β-内酰胺类抗生素、喹诺酮类、氨基糖苷类抗生素对MSSA感染的治疗效果较好;MRSA感染首选万古霉素或替考拉宁;利福平不能单独用于MRSA感染的治疗;呋喃妥因可用于创面伤口MRSA感染的治疗。     

NK13中(S)- 酮基布洛芬拆分用酯酶基因的克隆及表达

以本实验室筛选出的一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯的菌株NK13为材料,经初步鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),通过构建其基因文库,从中筛选得到一阳性克隆重组子pUC-NK。测序分析表明,该重组子质粒中包含一长度为933bp的酯酶基因的完整开放阅读框,核苷酸同源性对比证明该酯酶基因属首次发现（GenBank登录号为DQ196347）,将此基因克隆到原核表达载体pET21b+中构建重组表达质粒pET-NKest,转化E.coli BL21,经IPTG诱导在宿主菌中得到表达,经SDS-PAGE电泳检测证明该酯酶蛋白分子量约为34KDa。薄层层析与HPLC检测结果显示,表达菌株的转化效率较原始菌有明显提高,由表达菌45min就能转化酮基布洛芬氯乙酯47.4％,而得到的(S)-酮基布洛芬过量（e.e.%）由野生菌NK13的5.84％提高到55.46％,提高将近10倍,说明该酯酶具有优先拆分得到(S)-酮基布洛芬的特性。