Bacillus amyloliquefaciens C-1胞外发酵产物对食源性致病菌抑菌活性的初步研究

对本实验室自行分离的解淀粉芽孢杆菌C-1进行发酵,离心得到其上清液,平板抑菌实验结果显示该菌上清液对蜡样芽孢杆菌MS10362R、大肠杆菌ATCC 25922及厌氧梭菌(Clostridium difficile QB21)有较强的抑菌活性;在生长曲线测定中,4 mL C-1上清液可显著延长B.cereus MS10362R细胞的迟缓期,抑制细菌生长,且可排除pH等物理因素的影响,确定了C-1发酵上清液的抑菌活性;同时发现其对于MS10362R次生代谢产物-黑色素的产生和产量具有明显的抑制作用,初步推测可能与抑制细菌的群体感应有关;而从C-1上清中提纯的胞外多糖被证明不具有抑菌活性。     

芽孢杆菌dhs-330产脂肽-糖脂混合型表面活性剂的抑菌性能

目的:芽孢杆菌dhs-330分离自海水,能够产生脂肽-糖脂混合型表面活性剂。考察该菌株产物的抑菌性能。方法:采用抑菌圈法考察dhs-330发酵液对不同指示菌的抑菌活性,对提取的dhs-330产物进行最小抑菌浓度(MIC)测定,并考察该产物对温度、盐度和pH值的稳定性。结果:菌株dhs-330产物对嗜水气单胞菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有抑菌作用,MIC分别为0.005、0.01、0.01和0.02 g/L;经100℃处理20 min、pH2~10处理30 min,或盐度为0~50的条件下,产物仍具有抑菌活性或略有下降。结论:海洋来源的芽孢杆菌dhs-330胞外脂肽-糖脂混合型产物具有抑菌活性,且在高温、低pH值和高盐度条件下具有稳定性。     

金黄色葡萄球菌拮抗菌株的筛选鉴定及其抗菌物质分析

【背景】植物内生菌的次生代谢产物是新型天然活性物质的重要来源。【目的】从芍药内生细菌中筛选对金黄色葡萄球菌有抑菌活性的菌株和次生代谢产物。【方法】采用平板对峙法筛选拮抗菌株,根据形态学特征和分子生物学的方法鉴定菌株,PCR扩增检测合成脂肽类物质的功能基因;运用牛津杯法依次测定内生细菌发酵液和脂肽类粗提物的抑菌活性,利用Sephadex LH-20凝胶层析分离脂肽类物质,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析具有抑菌作用的分离组分。【结果】共筛选出13株对金黄色葡萄球菌具有不同程度抑制作用的内生菌株,其中菌株SY11的抑菌作用最为显著,其发酵液和脂肽类粗提物均具有较强的抑制作用。结合形态学鉴定以及16S r RNA基因序列分析,鉴定其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。PCR扩增检测表明菌株SY11含有3个合成脂肽类物质的功能基因fenA、ituD和srfkn,推测该菌株可能具有合成脂肽类物质的能力。根据具有抑菌活性分离组分的质谱分析结果,推测其有效物质的主要成分为Bacillomycin D。【结论】解淀粉芽孢杆菌SY11对金黄色葡萄球菌有良好抑制效果,其脂肽类粗提物也具有较强的体外抑菌活性。本研究为芍药内生细菌的开发应用奠定了基础。     

bmy基因敲除对解淀粉芽孢杆菌Q-426溶血性及抗菌活性的影响

Iturin家族环脂肽对于红色毛癣菌等病原真菌具有较强的抑菌活性,有潜力成为治疗皮肤疾病的新型抗真菌药物。解淀粉芽孢杆菌Q-426菌株能够产生环脂肽fengycins和iturin家族的bacillomycin D,但该菌株发酵液具有溶血活性。为确定bacillomycin D是否为引发溶血作用的主要物质,本文利用同源重组基因敲除技术,构建解淀粉芽孢杆菌bmy基因缺失菌株,抑制bacillomycin D的合成,研究对其溶血性及抗菌活性的影响。突变菌株发酵液中未检测到bacillomycin D产生,且发酵液的溶血性及抗菌活性明显减小,表明bacillomycin D与该菌的溶血活性及抑菌活性密切相关。     

枯草芽孢杆菌JA脂肽类及挥发性物质抑菌效应的研究

枯草芽孢杆菌JA产生的脂肽类抗生素对植物病原真菌有广谱抗性.将发酵液经过酸沉淀、甲醇抽提以及反相高效液相色谱等步骤,分离得到脂肽类抗生素的纯品.经IC50实验和抗菌谱测定,考察了脂肽类抗生素对多种植物病原菌的作用,确定了脂肽类抗生素的抗菌谱.深入研究表明,枯草芽孢杆菌JA还产生未知成分的挥发性抑菌物质,能够抑制灰霉病菌孢子的萌发和菌丝的生长.脂肽类抗生素和挥发性抑菌物质的协同作用,有助于提高枯草芽孢杆菌的生物防治效果.     

枯草芽孢杆菌JA脂肽类及挥发性物质抑菌效应的研究

枯草芽孢杆菌JA产生的脂肽类抗生素对植物病原真菌有广谱抗性。将发酵液经过酸沉淀、甲醇抽提以及反相高效液相色谱等步骤, 分离得到脂肽类抗生素的纯品。经IC50实验和抗菌谱测定, 考察了脂肽类抗生素对多种植物病原菌的作用, 确定了脂肽类抗生素的抗菌谱。深入研究表明, 枯草芽孢杆菌JA还产生未知成分的挥发性抑菌物质, 能够抑制灰霉病菌孢子的萌发和菌丝的生长。脂肽类抗生素和挥发性抑菌物质的协同作用, 有助于提高枯草芽孢杆菌的生物防治效果。     

胶胨状芽孢杆菌拮抗菌株活性物质形成条件及其性质初步研究

探索了培养基组分和培养条件对胶胨状芽孢杆菌拮抗菌株抗菌活性形成的影响。确定了菌株的最适发酵条件 :即以 1 %麦芽糖为碳源 ,以 0 1 % (NH4 ) 2 SO4 为氮源 ,32℃～ 37℃摇瓶培养 ,在培养过程中保持pH近中性有利于菌株生长和积累活性产物。从发酵液中获得抗生物质粗品 ,该物质对G+ 的蜡样芽孢杆菌 ,金黄色葡萄球菌和G- 的大肠杆菌等均有较强抗菌活性。经热处理、酶处理和生化定性分析 ,表明此活性产物为肽类化合物     

云贵川湖泊芽孢杆菌分离、鉴定及抗动物病原菌活性研究

为从湖泊沉积物中筛选出对动物病原菌具有抑菌活性的芽孢杆菌Bacillus,采用纯培养方法对云贵川地区9个湖泊样品中的芽孢杆菌进行分离、16S rRNA基因序列测定和发酵,以4株常见动物病原菌作为对象,对芽孢杆菌次级代谢产物进行活性检测,筛选有抗菌活性的菌株,并对活性菌株的发酵产物进行液相色谱-质谱联用技术分析。结果显示,在9个湖泊样品中共分离出47株芽孢杆菌,筛选出13株有抗菌活性的菌株,且其产生的脂肽类抗生素对动物病原菌显示出较好的抗菌活性。本研究不仅扩大了芽孢杆菌物种资源信息库,为后续开展芽孢杆菌次生代谢产物研究奠定理论依据。同时也为开发新型动物致病菌抗生素提供了新的途径。     

解淀粉芽孢杆菌Q-426 Bacillomycin D的分离纯化及其抗肿瘤活性

环脂肽化合物因其独特的结构特点和生物活性在医药领域具有广泛的应用前景。本研究旨在从解淀粉芽孢杆菌Q-426发酵液中分离纯化获得高纯度的环脂肽单体,并对分离得到的环脂肽C-15 Bacillomycin D和C-16Bacillomycin D的抗肿瘤活性及机制进行初步研究。首先,联合使用酸沉淀和双树脂层析去除大量杂质,然后通过制备型HPLC分离得到纯度较高的两种环脂肽,经ESI-MS/MS对其进行结构鉴定,分别确定为C-15Bacillomycin D与C-16 Bacillomycin D。其次,将两种环脂肽单体及其1:1混合液(摩尔比)按不同浓度梯度作用于人癌细胞(Hela、MG、Hep-G2、HT-29),结果表明环脂肽对Hela与MG细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖性,长链环脂肽的抑制率较短链环脂肽略高。最后,采用细胞划痕实验和PI染色法考察了C-16 Bacillomycin对细胞侵袭与迁移能力、细胞凋亡和周期的影响,结果显示,C-16 Bacillomycin D可有效影响细胞的迁移能力,诱导细胞凋亡呈浓度依赖性,且阻滞细胞G_0G_1期。     

一株扩展青霉拮抗菌的分离、鉴定及抑菌活性物质

【目的】筛选有效抑制扩展青霉(Penicillium expansum)的拮抗菌,并鉴定其所产抑菌物质的主要种类及相对含量。【方法】从苹果表面分离到拮抗扩展青霉的菌株BA-16,经形态学、生理生化及16S r RNA基因序列分析对该菌进行鉴定;根据已知脂肽类抗生素合成相关基因序列设计3对特异性引物对菌株BA-16进行检测,对PCR产物克隆、测序和BLAST分析,采用酸沉淀法从菌株发酵液中制备出抑菌物质粗提液,对活性粗提物进行HPLC和MALDI-TOF-MS分析。【结果】经鉴定,BA-16被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),所得PCR产物经测序和BLAST分析,证实BA-16带有sfp和fen B基因。HPLC和MS结果显示菌株发酵液中含有Fengycin和Surfactin两种脂肽类产物,Fengycin是拮抗扩展青霉的主要因素。【结论】本研究对于苹果采后青霉病的生物防治具有良好的应用开发前景。     

蜂胶活性提取物抑菌效果的研究

采用超声波乙醇浸提法和超临界CO_2萃取法制备蜂胶活性提取物,分别以70%乙醇、丙三醇、聚乙二醇400作为溶剂将蜂胶活性提取物制成溶液.并通过超声波和加热方式对蜂胶活性提取物溶液进行预处理,观察其对常见食品致病菌的抑菌和延长鲜牛肉的保鲜期效果.结果表明:两种蜂胶活性提取物溶液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌、黑曲霉、产黄青霉均有不同程度的抑菌效果,其中对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌抑菌效果较好.同时发现两者都能较好地延长鲜牛肉的保鲜期.     

枯草芽孢杆菌HS-A38产抗菌脂肽Bacillomycin D的组分分析及鉴定

对一株枯草芽孢杆菌HS-A38产生的脂肽类物质进行分离鉴定及抑菌活性研究。通过酸沉淀分离和有机溶剂抽提的方法,从枯草芽孢杆菌HS-A38发酵液中得到脂肽粗提物LP,产率为1.956 g/L。利用薄层色谱和茚三酮染色法确定该脂肽粗提物中存在四个组分,分别为LP1、LP2、LP3和LP4;抑菌活性检测显示,组分LP3对两株海洋致病菌副溶血性弧菌和铜绿假单胞杆菌的活性较高。组分LP3经硅胶柱层析纯化分离后,应用反相高效液相色谱(RP-HPLC)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对该组分做进一步纯化和鉴定。分析表明,LP3样品在保留时间20 min~28 min产生单峰团LP3-1,其纯度为85.24%;经MALDI-TOF-MS分析和数据比对,组分LP3-1中的主要成分为杆菌霉素Bacillomycin D。     

汤姆青霉PT95和Q1菌株产酶活力及抗菌活性研究

为探讨汤姆青霉菌株产酶活力以及抑菌性能。实验采用Folin酚法、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)糖化力法、二硝基水杨酸(DNS)比色法和对硝基苯酚法进行蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和脂肪酶活力测定;同时采用牛津杯法测定发酵滤液对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)的抑制作用,并测定最小抑菌浓度(MIC)。结果表明PT95菌株产蛋白酶活力为230.473 U、纤维素酶活力为3.463 U,产淀粉酶活力为1.679 MMU、脂肪酶活力10.793 U;Q1菌株产蛋白酶活力为167.247 U、纤维素酶活力为2.147 U,产淀粉酶活力为1.402 MMU、脂肪酶活力为6.350 U;PT95菌株对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌抑菌率分别可以达到53.73%和19.47%,Q1菌株对三种待测菌都有抑菌作用,抑菌率分别是56.37%(枯草芽孢杆菌)、26.87%(金黄色葡萄球菌)和19.47%(大肠杆菌),两株菌株发酵液中均存在抑菌物质,且均对枯草芽孢杆菌的抑菌率最高,两株菌的发酵液对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为0.64和0.32 mg/mL。     

一株硅酸盐细菌抗生代谢产物分离和特性

对硅酸盐细菌CS2 9菌株的抗菌产物进行了分离、纯化 ,从其发酵液中得到的化合物FA对金黄色葡萄球菌等G+ 和G-菌具有显著抑制活性 ,对蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度 (MIC)达到 7μg/ml。经核磁共振波谱、红外光谱和质谱数据分析 ,表明FA为多羟基黄酮类化合物 ,分子量30 2。     

南极适冷菌Pseudomonassp．C抑菌活性物质的分离纯化与结构鉴定北大核心CSCD

本文对南极适冷菌Pseudomonassp．c发酵液上清中的抗植物病原菌活性物质进行了研究,结果表明在温度40-70℃和pH5—9的范围内发酵液上清的抑菌活性稳定。根据活性追踪,通过硅胶柱层析和高效液相色谱对发酵液上清中的抑菌活性物质进行了分离纯化,得到了3个对常见植物病原真菌尖孢镰刀菌具有抑菌活性的化合物,并对其中的两个化合物进行了结构鉴定。化合物1为环二肽类（环（苯丙氨酸-脯氨酸））,化合物2为壬基酚聚氧乙烯醚类（14-壬基苯氧基．3,6,9,12．四氧十四烷-1-醇）,两者对枯草芽孢杆菌也具有一定的抑菌活性。     

牛源致病性蜡样芽孢杆菌溶血素BL亚基的原核表达及其生物学活性分析

蜡样芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌,分布广泛,具有一定的致病性。不同的蜡样芽孢杆菌携带有不同的毒力因子,这直接决定了蜡样芽孢杆菌株致病性的差异。研究和探讨毒力因子分布以及具体毒素的生物活性有助于对蜡样芽孢杆菌病采取更科学的防控。本研究通过原核表达系统将溶血素BL三亚基重组表达,并对表达蛋白进行了纯化和部分生物学活性的检测。研究结果表明,牛源致病性蜡样芽孢杆菌溶血素BL可以在原核表达系统中成功表达和纯化,牛源致病性蜡样芽孢杆菌溶血素BL拥有溶血性、细胞毒性、很好的免疫原性以及对小鼠具有一定的免疫保护性。本研究表达了溶血素BL三亚基,并探究了牛源致病性蜡样芽孢杆溶血素BL的生物学活性。本研究为进一步揭示蜡样芽孢杆菌溶血素BL的致病作用机制和建立针对牛源致病性蜡样芽孢杆菌病的检测方法奠定了理论基础。     

一株分离自海水的产生物表面活性剂菌株的鉴定及其发酵优化

为研究分离自海水的芽孢杆菌dhs-330产生物表面活性剂的培养条件和产物特性,采用16S r DNA基因序列分析鉴定菌种,对发酵培养基的碳源、氮源、p H值和培养温度进行优化,采用飞行时间质谱进行产物鉴定及抑菌圈法考察产物抑菌活性。结果显示,该菌株与Bacillus mojavensis菌株16S r DNA的序列相似性为99%。菌株发酵液表面张力可由70 m N·m-1降低至27 m N·m-1。发酵培养基的最适碳源、有机氮源和无机氮源分别为甘油、酵母膏和尿素;p H值为6.5~7.0、温度为30~35℃条件下,菌体生长和生物表面活性剂合成最为有利。发酵产物为脂肽-糖脂混合型生物表面活性剂,对海洋污损微生物Bacillus pumilus dhs04有显著的抑菌活性。菌株dhs-330是能合成脂肽-糖脂混合生物表面活性剂、具有海洋污损微生物防除潜力的优选菌株。     

荷叶黄酮对食源性致病菌的抑菌活性初步研究

目的比较荷叶黄酮对不同食源性致病菌的抑菌活性。方法从干荷叶中提取荷叶黄酮,选择3种食源性致病菌进行抑菌试验,并获得最小抑菌浓度(MIC);同时对荷叶黄酮的抑菌活性的热稳定性及p H稳定性进行分析。结果从干荷叶中提取出15%荷叶黄酮粗提干粉,抑菌试验证实食源性致病菌蜡样芽胞杆菌MS10362R、枯草芽胞杆菌subsp.subtilis str.168和福氏志贺菌CDC1对荷叶黄酮的作用较为敏感,并且具有显著的浓度依赖性,其MIC分别为1.0、1.5和3.5 mg/m L。不同的热处理(50~90℃)对荷叶黄酮的抑菌活性影响较小,其在90℃处理后对蜡样芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌和福氏志贺菌的抑菌活性分别降低了35.89%、23.86%和28.72%。随着p H的升高(p H 5.0~9.0),荷叶黄酮的抑菌活性呈现先升后降的趋势,但变化不大,在中性偏碱的溶液环境中抑菌活性较高。结论荷叶黄酮抑菌活性稳定,可作为食品添加剂开发,具有潜在的应用潜力。     

风信子中抗青霉素内生菌的分离、筛选和活性检测

通过用初筛培养基培养,从风信子叶子中分离出一种抗青霉素的内生菌,进行离体培养和抑菌活性检测。结果表明所筛选的菌株的发酵产物对细菌和真菌均有一定的抑菌活性。其中发酵液提取物对枯草芽孢杆菌有一定的抑菌活性,对苹果干腐病原菌和烟草赤星病原菌的抑菌率分别是94.8%和93.8%,而菌体内的活性物对蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌都有较高的活性,对苹果干腐病原菌、烟草赤星病原菌和苹果轮纹病原菌的抑菌率都在80%以上。     

桑树内生拮抗菌的分离鉴定及其对桑断枝烂叶病的生防初探

【目的】本研究从健康桑树茎中分离筛选对桑断枝烂叶病菌具显著拮抗作用的内生细菌,为该病生物防治奠定研究基础。【方法】采用组织培养法分离桑树内生菌,抑菌圈法和平板对峙法筛选抑菌活性稳定的内生拮抗菌;根据形态学、生理生化特征检测和基于16SrDNA、gyrA和gyrB基因的系统发育分析对拮抗菌进行菌种鉴定;利用抑菌圈法测定拮抗菌株活性发酵液热稳定性,菌丝生长速率法检测活性发酵液抑菌谱;并通过观察拮抗菌对桑断枝烂叶病菌BoeremiaexiguaGXH1菌株生长及菌丝形态的影响,扩增抑菌活性物质合成关键基因,以及采用酸沉淀法提取拮抗菌株脂肽类化合物并进行高效液相色谱串联质谱分析(LC-MS),初步探究可能的抑菌机制。【结果】从健康桑树茎中共分离获得17株桑树内生细菌,并从中筛选获得一株对桑断枝烂叶病菌B.exiguaGXH1有稳定拮抗作用的桑树内生细菌NPJ13菌株。该菌株形态学、生理生化特征与芽孢杆菌属一致,基于16SrDNA、gyrA和gyrB基因序列的系统发育分析结果显示该菌株与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)的亲缘关系最近,且处于系统发育树的最小分枝,故将NPJ13菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌,命名为B. velezensis NPJ13。NPJ13菌株对灰霉病菌SWU5、核地杖菌SXSG-5、核盘菌PZ-2及烟草疫霉SWU20等12种病原真菌具有不同程度的拮抗作用,其活性发酵液具有较好的热稳定性。NPJ13菌株会导致桑断枝烂叶病菌GXH1菌丝发生扭曲、膨大、透明度增加、断裂等畸变现象;基因检测结果显示NPJ13菌株基因组中具有PKSI、NRPS、Sfp、ItuD、Srfc等5种抑菌活性物质合成关键基因,LC-MS检测结果表明菌株NPJ13脂肽类粗提物中含有表面活性素和伊枯草菌素。【结论】本研究分离筛选获得一株对桑断枝烂叶病菌具有显著拮抗作用的桑树内生细菌B. velezensis NPJ13菌株,为桑断枝烂叶病的生物防治提供了候选菌株。