转基因烟草的甘露醇合成和耐盐性

土壤的盐碱性是世界许多地区限制植物生长和作物产量的主要制约因素。长期的研究发现:在高盐或干旱环境下,大多数植物在细胞质中开始积累一些低分子量的代谢物,如脯氨酸、甜菜碱、糖醇等。这些物质通过维持高的细胞质渗透压,有利于植物在高盐或干旱条件下的水分吸收。通过基因工程手段,影响或改变植物体内的生理代谢途径,使得植物细胞产生和积累不同的低分子量有机化合物,能够     

烟草C3HC4型锌指蛋白的原核表达及转基因植株功能研究

植物中C3HC4型RING锌指蛋白在泛素化、光形态建成、抗逆及生长发育等过程中均起到非常重要的作用。首次从本生烟中扩增获得一个锌指蛋白基因的完整阅读框,编码203个氨基酸,含有C3HC4型锌指结构域,命名为NbZFP1。将NbZFP1基因分别克隆到原核表达系统载体pGEX-6P-2以及pMAL-C2X中,成功构建了重组表达载体pGEX-6P-2-NbZFP1与pMALC2X-NbZFP1,经IPTG获得了大量可溶性表达的NbZFP1融合蛋白。将NbZFP1基因克隆于植物表达载体pBI121中,通过农杆菌介导法获得转基因烟草,PCR检测及Southern blot分析表明NbZFP1基因已整合到烟草基因组中,转NbZFP1基因烟草表现出株型紧凑,节间缩短,茎干粗壮和对TMV抗性增强。     

表达马铃薯Y病毒外壳蛋白的转基因烟草的抗病性研究

将马铃薯Ｙ病毒中国分离物（ＰＶＴ－Ｃ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因,在土壤农杆菌ＬＢＡ４４０４的介导下,转化烟草生产品种ＮＣ８９,获得了６个烟草株系。通过抗性分析发现,６个株系中有一个株系在２００μｇ／ｍｌＰＶＹ－Ｃ的攻毒下,仍未发病,分子检测发现,转基因植物中抗性产生的程度并不是同ＰＶＹ－Ｃ外壳蛋白的表达水平成正相关。     

黄瓜花叶病毒香蕉株系衣壳蛋白转基因烟草的研究

构了侵染香蕉的黄瓜花叶病毒两个株系的衣壳蛋白基因的植物表达载体,并通过农杆菌共培养法的基因枪法,分别将两个株系的ＣＰ基因转化入了两种烟草植株。其ＣＰ基因转化频率及植株再生率研究结果表明,农杆菌共培养法比基因枪法,土耳其烟比本生烟,农杆菌１：１０倍稀释液比培养原液和１：１００倍稀释液,具有更高的转化频率和植株再生能力。Ｓｏｕｔｈｅｍ ｂｌｏｔ,ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｍ ｂｏｌｔ检测ＣＰ基因整合研究结果     

利用Cre/lox重组系统获得无选择标记的SKTI抗虫转基因烟草

将置于两个同向lox位点之间的Bar基因表达盒与大豆胰蛋白酶抑制剂SKTI基因表达盒融合后获得相应植物表达载体,转化烟草Wisconsin 38后获得对棉铃虫具有明显抗性的SKTI转基因植株。SKTI转基因植株通过叶盘二次转化法导入Cre基因,对再生植株叶盘进行Basta的抗性检测,检测Bar基因的删除情况。结果表明:绝大多数再生植株对应叶盘在含8 mg/L PPT的筛选培养基上无法再生,Bar基因被删除的效率在38%~100%之间。对Bar基因删除区域进行PCR及克隆测序后发现Bar基因表达盒被精确删除。对Bar基因删除植株开花自交获得的分离后代进行NPTⅡ抗性检测,5株NPTⅡ敏感植株分子检测显示均只含有SKTI基因而无Cre基因存在,为无选择标记基因的SKTI转基因植株。     

高度耐盐双价转基因烟草的研究

随着全球性人口的增长和土地退化的加剧,开发利用广阔盐碱地和干旱土地的需要日益迫切。植物生物技术的日臻完善,为培育高效耐盐植物迎来了一丝曙光。在高渗条件下,耐盐的微生物或植物细胞通过增加胞内一些相溶性溶质的浓度来维持渗透压的平衡。这些可溶性溶质包括无机离子、糖类、多元醇、氨基酸和生物碱等。通过基因工程手段,使细胞内积累脯氮酸⑴、甜菜碱⑵、甘露醇⑶、海藻糖⑷,能够不同程度地提高转基因烟草的耐盐性。多元醇含有多个羟基,亲水性能强,能有效维持细胞内水活度。山梨醇、甘露醇等己糖分子结构、理化性质和生理功能相近。故此．我们认为：不同糖醇在转基因烟草中的积累．可能具有协同(或累加)效应,有希望更大地提高植物耐盐性。我们在获得大肠杆菌mtlD基因(编码l-磷酸甘露醇脱氢酶)和gutD基因(编码6-磷酸山梨醇脱氢酶)克隆⑸的基础上,获得了分别表达mtlD和gutD基因的单价转基因烟草,并首次证实了gucD基因的表达,能显著地提高转基因烟草的耐盐性⑹。本文工作进一步报道同时表达大肠杆菌mtlD和gutD基因双价转基因烟草的高效高度耐盐性。     

转基因烟草检测技术研究

本研究建立了转基因烟草常用调控基因35S启动子和nos终止子,标记基因npt-II和目的基因TMV－CP的PCR检测技术,并用轻构建的pUC18质粒提纯的35S启动子和nos终止子基因经地高辛标记后制成了基因探针,建立了检测35S启动子和os终止子的分子杂交技术,杂交试验证明,PCR扩增的35S启动子和nos终止子为特异性扩增产物,此项检测技术具有快速,特异,敏感,经济以及可重复性强等优点。     

转基因烟草的大田抗病性分析

为了尽快地将抗病转基因烟草品种应用于生产,在选育抗病优良株系的同时,进行了转基因株系的大田抗病性鉴定。结果表明：（１）在田间自然发病情况下,转基因烟草的ＮＣ８９各株系的发病率及病情指数显著低于对照ＮＣ８９,对ＣＭＶ的相对防治效果为５５％－７０％,表现较强的抗病性;同时对ＴＭＶ也有一定的抗病力;（２）转基因烟草的产量、产值也明显高于对照。     

利用转基因植物生产生物药

传统的生物技术常利用哺乳动物细胞、细菌和真菌培养作为转基因系统 ,来生产生物药。鉴于今后对生物药例如治疗贫血的红细胞生成素和治疗糖尿病的胰岛素 ,以及通过基因组研究发现的新的药用蛋白的需求量均将大量增加 ,故有必要利用另一种转基因系统来生产价格既低廉 ,使用又安全的重组生物药。认为适合于上述目的者为高等植物。利用转基因植物来生产重组药用蛋白和肽有很多优点 ,例如 :(1)植物容易转化 ;(2 )使用安全 ,因植物不是人类病原体的宿主 ,故与动物细胞培养比较 ,利用重组植物生产的生物药不论提纯与否 ,都不大有可能污染人类病原…     

ipt基因定位表达对转基因烟草育性的影响

杂种优势是生物界的一种普遍现象。作物杂种优势的利用是培育高产、抗逆、优质新品种的重要手段之一。然而 ,常规育种技术获得配套三系的难度很大 ,由此限制了杂种优势利用的发展。近年来应用转基因技术创造雄性不育植株已有不少报道[1- 5] 。有研究表明 ,自然突变的雄性不育株     

核基质结构区在转基因烟草中对转基因表达的影响

为研究核基质结合区（matrix attachment regions,MARs）在转基因植物中对源转基因（transgene）表达的影响,将来源豌豆（Pisum sativum L.）的MARs序列构建在报告基因β－葡糖醛酸酶（β-glucuronidase,GUS）基因（uidA）的两侧形成植物表达载体。将此载体与不包含MARs序列的植物表达载体经根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens(Smith et Townsend)Com）介导转化烟草（Nicotiana tabacum L.）。GUS活性检测表明,MARs可以提高外源uidA基因的表达水平,和不包含MARs的转化植株相比,MARs序列的存在可以使uidA基因的平均表达水平提高2倍高的可达5倍。     

转基因植物生产药用蛋白研究进展

转基因植物作为生物反应器能生产医学上有生物活性的药用蛋白,该文对转基因植物生产医药蛋白的种类、途径及优缺点、改进措施进行了阐述。     

利用转基因植物生产药用蛋白研究进展

简要评述了国内外利用转基因植物生产药用蛋白的研究现状、发展趋势,以及转基因植物生产药用蛋白的基本方法、应用研究等。尽管目前植物作为药用蛋白的生物反应器受到诸多因素限制,优点与问题并存,但利用转基因植物生产药用蛋白是植物基因工程研究领域的一个新的发展趋势。     

转基因烟草荧光定量检测方法研究

依据实时定量PCR原理,参照35S启动子、NOS终止子、GUS基因和NPTII基因序列设计TaqMan引物和荧光标记探针。采用美国MJ公司OpticonTM2荧光定量PCR检测系统对烤后烟叶进行转基因定量检测技术研究,从中筛选出扩增效率高,灵敏度好的PCR引物和探针序列,同时通过对扩增体系,扩增条件的梯度实验,优化出荧光定量检测的最佳反应体系和反应条件,从而建立了转基因烟草定量检测方法。该方法经验证其检测灵敏度达到0.05％。在2003年6月参加CORESTA(国际烟草科研与合作中心)组织的国际烟草转基因定量检测合作试验中,该优化转基因烟草定量检测技术获得了较好成绩,对盲检样品检测结果评价(Z-score)列国际12家实验室之首,证明此法灵敏度高、稳定性好。     

葡萄蔗糖转运蛋白在烟草中的反义表达及其对转基因烟草的影响

将葡萄蔗糖转运蛋白VvSUC27cDNA以反义方向插入到含有CaMV35s启动子的真核表达载体pBI121载体中,然后转化到烟草(Nicotianatobacumcv.Samsun)植株中.转反义VvSUC27cDNA的烟草植株在含有20g/L蔗糖的培养基上能够正常生长发育,但是通过切片观察,发现其根部发育较弱,且叶片叶绿体含量增加.可溶性糖测定发现,转基因烟草根部蔗糖含量只有野生型烟草的51%.14C蔗糖吸收实验发现转基因烟草转运外界蔗糖的能力大大降低.     

表达黄瓜花叶病毒卫星RNA的转基因烟草耐烟草花叶病毒

表达黄瓜花叶病毒(CMV)的卫星RNA的转基因烟草可以抗CMV的侵染.为了决定这些植物对其它病毒,如烟草花叶病毒(CMV)的安全性,我们对这些植物接种CMV.结果发现 卫星RNA可减弱TMV引起的症状,井降低病情指数,然而却对TMV在植物中的积累没有明显影响.这一发现有助于对卫星RNA抗病机制的理解,有助于含卫星RNA的生防制剂及表达病毒卫星RNA的转基因植物的应用.本文在国际上首次报道卫星RNA可减弱非相关病毒引起的症状.1 材料和方法1.1 病毒及植物烟草花叶病毒(TMV),烟草G140种子及枯班三生烟种子均为中国科学院微生物研究所病毒室保存;含黄瓜花叶病毒卫星RNA-R1基因的烟草G140(烟Sat-G140)为中国科学院微生物研究所病毒室培育,所用材料为第三代种子.     

应用RNAi技术培育抗TMV病毒转基因烟草

利用烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白基因构建RNAi干涉载体, 通过叶盘法转化至烟草K326 和龙江911两个栽培品种。对转基因株系的荧光定量PCR分析表明, 不同转基因株系的病毒RNA靶序列都得到一定程度的降解, 抗病性鉴定结果证实, 转基因K326和龙江911两个栽培品种的转基因材料分别有83％和90％转基因株系对TMV呈现免疫级抗性。     

采用GUS标记技术研究钙调素在转基因烟草中的分布

为了监测钙调素 (Ca M)在植物细胞内的分布并探索其生物学功能 ,将水稻 Ca M和 GU S融合基因 (cam.gus)分别置于 35 S启动子和花粉特异启动子 L AT5 2 - 7控制下 ,构建出载体 p MD/ Ca M.GU S和 p BI/ L AT.Ca M.GU S,转化烟草 (N icotiana tobacum cv.SR ) ,GU S染色结果显示 ,Ca M.GU S融合蛋白广泛分布于植物根、茎、叶等组织 ,根尖生长点细胞、根毛细胞、表皮毛细胞、气孔保卫细胞、维管束细胞的细胞质中融合蛋白含量较多。花粉粒中也分布着 Ca M,并在萌发沟处表现出较高的浓度。保卫细胞和表皮毛细胞中 Ca M分布在相邻细胞连接处细胞模内侧 ,呈现出极性分布。研究结果表明 ,细胞内 Ca M的不均匀分布可能与细胞功能相关。     

利用双T-DNA载体系统培育无选择标记转基因烟草

建立了一种利用双T-DNA载体培育无选择标记转基因植物的方法。通过体外重组构建了双T-DNA双元载体pDLBRBbarm。载体中,选择标记nptⅡ基因和另一代表外源基因的bar基因分别位于2个独立的T-DNA。利用农杆菌介导转化烟草(Nicotiana tabacum L.),在获得的转化植株中,同时整合有nptⅡ基因和bar基因的频率为59．2％。对4个同时整合有nptⅡ和bar基因植株自交获得的T1代株系进行检测分析,发现在3个T1代株系2个T-DNA可以发生分离,其中约19．5％的转基因T1代植株中只存在bar基因而不带选择标记nptⅡ。这一结果说明双T-DNA载体系统能有效地用于培育无选择标记的转基因植物。研究还利用位于2个不同载体上的nptⅡ基因与bar基因通过农杆菌介导共转化烟草,获得共转化植株的频率为20．0％～47．4％,低于使用双T-DNA转化的共转化频率。