大肠杆菌发酵重组人干扰素—α2a的高密度,高表达

利用NBS公司的BioFloⅢ发酵罐,采用培养基流加的方式培养表达人干扰素的E．coli工程菌,结果湿菌重达128g／L,干扰素活性达98×1010U／L发酵液。     

重组大肠杆菌高表达高密度发酵研究

大肠杆菌高密度高表达发酵技术是现代发酵工程的重要研究课题,此项技术可以有效地提高大肠杆菌的产量和外源重组蛋白的表达量,该文就影响大肠杆菌高密度发酵的主要因素如宿主菌类型、培养基组成、培养条件、生长抑制物质、补料调控等进行了阐述和讨论。     

重组人白细胞介素—2制备工艺的研究

本文对大肠杆菌表达的重组人白细胞介素-2进行了制备工艺的研究。用4mol／L脲溶解可溶性细菌蛋白后可使rIL—2包涵体纯度达70％;在变性条件下进行凝胶过滤并收集rlL－2主峰纯度可达90％;利用Cu2 氧化复性;最后用反相HPLC纯化,得到高度均一,纯度高达98％,比活达到8．0×106U／mg蛋白,且无热源,无残留DNA的rIL—2;每次反相色谱分离过程可获得400mg左右的rIL－2,得率约25％。     

重组大肠杆菌高密度发酵研究进展

重组大肠杆菌的高密度发酵是提高基因工程产品产量的一个非常有铲的手段,是现代发酵工程研究的一个热点。本文就高密度发酵中影响重组大肠杆菌发酵产率的几个因素,包括宿主菌、培养基、培养条件、补料方法以及高密度发酵过程中存在的问题和对策加以讨论,着重探讨了高密度下大肠杆菌产生的有害代副产物－－乙酸的产生机制、抑制作用机理,以及控制乙酸机累的技术方法。     

人白细胞介素－3在大肠杆菌中的高效表达

人白细胞介素－３（ｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ３,ｈＩＬ－３）是一种造血前体细胞早期分化的关键调节因子。用ＰＣＲ方法从人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库中扩增出０．４４ｋｂ的ＤＮＡ片段,并克隆入ｐＵＣ１９载体中。经ＤＮＡ序列测定,确定０．４４ｋｂ的ＰＣＲ产物合完整的编码人白细胞介素－３成熟蛋白ｃＤＮＡ序列,并在信号肽与成熟蛋白编码序列之间通过突变引入了限制性内切酶位点和ＡＴＧ起始密码。构建的ＰＬ启动子控制下的ｈＩＬ－３ｃＤＮＡ表达质粒,转入大肠杆菌Ｔａｐ１０６,经４２℃热诱导,获得ｈＩＬ－３的表达产物。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示表达产物为１５ｋｄ,约占细菌总蛋白的１５％。表达产物经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ验证。ｈＩＬ－３表达产物在细胞内形成包涵体,纯化包涵体,使产物纯度提高到７０．８％,产物复性后,能明显促进ｈＩＬ－３依赖细胞株生长,具有明显的生物活性。产物转移到ＰＶＤＦ膜后进行Ｎ端序列分析,Ｎ端１６个氨基酸正确。     

人白细胞介素—3基因翻译起始区的改造提高其在大肠杆菌中的表…

为了提高人白细胞介素－３（ｈＩＬ－３）在大肠杆菌中的表达,在计算机辅助下,设计台成了ＰＣＲ突变引物,用于改造起始密码ＡＵＧ上下游序列,并在不改变５’端氨基酸编码的前提下,尽可能选用大肠杆菌高频使用的密码子。将经改造后的ｈＩＬ－３ｃＤＮＡ和翻译起始区置于ＰＬ启动子之下,转入大肠杆菌Ｔａｐ１０６,经４２℃热诱导后,获得表达产物,提高表达水平近一倍,表达量达到菌体总蛋白量的３０％左右。表达产物经Ｗｅｓｔ     

反相高压液相色谱折叠重组人白细胞介素-2

重组人白细胞介素－２（ｒｈＩＬ－２）基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过菌体发酵和收集、超声破菌、包涵体抽提、稀释透析初步复性、反相高压液相色谱纯化,终产物纯度大于９９％。反相高压液相色谱不仅可以纯化ｒｈＩＬ－２,且使产物的总活性提高７．９－９倍,比活性提高１４￣１８倍,达到１．５×１０＾７ｕ／ｍｇ蛋白质,蛋白得率为５０％￣５６％。结果表明,反相高压液相色谱具有纯化和显提高ｒｈＨ     

重组酵母菌的高密度发酵表达

酵母作为一类外源基因的表达系统具有很多优点 ,有许多外源基因在工程酵母菌表达生产重要的外源蛋白[1] 。从生理学角度看 ,作为外源基因的受体细胞 ,酵母的生理和遗传特性影响着外源基因的表达。同时 ,外源基因的表达 ,特别是高表达的外源蛋白对宿主细胞有抑制作用甚至会导致细胞中毒或死亡。再加上工程菌的培养过程中的不稳定性问题的存在 ,因此 ,菌体细胞的高浓度和目的基因的高表达是一对矛盾 ,它们互相制约 ,构成生物工程研究的重要工作之一。1 .工程酵母菌的高密度发酵酵母的高密度发酵是一个相对概念 ,一般指发酵液中酵母浓度在 30 …     

人白细胞介素—2 cDNA在大肠杆菌中的高效表达及其纯化

白细胞介素—2(IL-2),过去曾称为T细胞生长因子(TCGF),是在促有丝分裂素或特异性抗原刺激下,由辅助性T细胞产生的一种淋巴因子,能在体外长期维持T细胞生长。它可调节免疫反应,促进细胞毒性T细胞和NK细胞增殖,诱生γ干扰素。因而是治疗肿瘤和免疫缺陷病人的非常有希望的药物之一。     

重组人钙调素的制备及其对细胞增殖作用影响的研究

用PCR方法获得人钙调素基因Ⅲ(hCaMⅢcDNA),将其插入表达载体pBV220,构建重组表达质粒hCaMⅢ/pBV220,阳性重组子在大肠杆菌DH5α中经温度诱导可高效表达CaM蛋白,经15%SDS-PAGE分析,可观察到一分子量与理论值相符(约17kD)的诱导表达条带.进一步分析表达产物的性质表明,CaM主要以可溶性形式表达.Westernblot结果证实,17kD的表达条带可与标准鼠抗CaMMcAb起特异反应.用Phenyl-SepharoseCL-4B疏水亲和层析法纯化重组菌超声上清表达产物,可获得纯度达95%以上的CaM,每1L菌液可获CaM纯品3～4mg.生物活性测定结果提示,rhCaM具有与标准人脑CaM(Sigma)同样的激活NAD激酶的活性.将K562细胞及SP2/0细胞分别接种于24孔或96孔培养板,加入不同浓度rhCaM、CaM拮抗剂三氟拉嗪(TFP),培养48h后,用MTI比色法检测细胞增殖状况.rhCaM在一定浓度范围内与细胞增殖率成显著正相关;CaM拮抗剂TFP可抑制细胞增殖.将rhCaM加入已受TFP抑制的细胞,可恢复正常的细胞增殖功能.     

在大肠杆菌中高效表达人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)核心蛋白

将编码人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)核心蛋白(Gag)P24的大部分基因片段,插入大肠杆菌表达载体pEX31A中,获得的表达产物MS2-Gag融合蛋白占菌体总蛋白的20％左右。Western blot结果证明,这种表达产物能被艾滋病(AIDS)患者血清中的特异性抗体所识别。这是国内首次报道在大肠杆菌中高效表达人类免疫缺陷病毒Ⅰ型核心蛋白。对表达的重组核心蛋白的意义及应用前景进行了讨论。     

乙酸积累对基因工程菌培养的影响及与培养基pH的关系

在rIL-2工程菌K_(802)(pLY—4)高密度培养中,发现培养液中有大量代谢副产物乙酸积累,乙酸的存在对工程菌的生长和产物的表达均有明显的抑制作用,这种抑制作用是制约工程菌高密度培养的重要因素。为了减小这种抑制作用,初步研究了培养基pH与乙酸抑制作用的关系,发现适当提高培养基pH值,能减小乙酸的抑制作用;高密度培养时,提高培养基的pH后,虽然仍有大量乙酸积累,但产物的表达水平和菌密度都有提高。     

具有高谷胱甘肽合成活性重组大肠杆菌的构建及合成反应过程

以野生型大肠杆菌E.coliⅡ为宿主细胞,转化带有编码谷胱甘肽合成酶系的基因gshⅠ和gshⅡ的质粒pGH501,获得了一株谷胱甘肽合成活性、质粒稳定性和传代稳定性俱佳,并且能够重复使用的重组大肠杆菌E.coliⅡ\|1。该菌株经过甲苯处理后,能够在胞外积累4g/L左右的谷胱甘肽(GSH)。在合成反应体系中,提高L谷氨酸浓度可促进GSH合成,但L半胱氨酸浓度增大到20mmol/L后会抑制GSH的合成。根据GSH合成反应中能量辅因子的变化情况,提出E.coliⅡ\|1细胞控制的GSH合成反应机理：由谷胱甘肽合成酶(GSHⅡ)控制的第二步反应的能量供体是ADP而非ATP,该反应是整个GSH合成反应的限速步骤,高浓度ADP可能会抑制GSHⅡ的活性。在GSH合成反应体系中添加100mmol/L的L丝氨酸-硼酸钾混合物,可以有效地防止GSH的进一步降解,反应3 h后,GSH产量达到230mmol/L(约71g/L)。     

传染性法氏囊病病毒VP3结构蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达

传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）是危害养鸡业的重要病原之一,属双股双节段ＲＮＡ病毒科成员,由Ａ和Ｂ两个片段的ｄｓＲＮＡ构成,大小分别约３３００－３４００ｂｐ和２８００－２９００ｂｐ。基因片段Ａ首先编码ＶＰ２－ＶＰ４－ＶＰ３聚合蛋白,然后再断裂成ＶＰ３、...     

重组人碱性成纤维细胞生长因子基因工程菌的高密度培养

根据重组人碱性成纤维细胞生长因子基因工程菌的生长特点,对其高密度发酵工艺条件进行研究和改进,采用“平衡DO-State”控制策略进行分批补料培养中的葡萄糖流加,有效地控制了培养过程中代谢副产物-乙酸的产生及其对工程菌生长的抑制作用,使发酵终了时乙酸浓度由15．6g/L下降为2.6g/L,而菌体密度则由15．2gDCW/L提高到30．2gDCW/L。     

人重组白蛋白基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

The yeast Pichia pastoris was transformed by the multi\|copy Pichia expression vector that can express secreted human albumin.The high level expression of cell line was selected after screening.The expression of human recombinant albumin in Pichia pastoris induced by different methods were compared.The retio of secreted human albumin is 80% in total secreted proteins and the expression level reaches as high as is 10g/L.     

猪肥胖基因在大肠杆菌中的高效融合表达

采用PCR方法扩增猪肥胖基因编码原成熟蛋白cDNA序列,并在5′端加上BamHⅠ位点,3′端加上EoRⅠ位点,将5′端密码子CCC转变为大肠杆菌常见密码子CCG,扩增得到459bp的片段,克隆于融合表达载体p GEX-2TBamHⅠ和EcoRⅠ位点,酶切、测序正确,经0．1mmol/LIPTG诱导表达出一条约42kD的融合蛋白,其中26kD为pGEX-2T中带有的谷胱苷肽转移酶,16kD是猪肥胖基因表达产物瘦蛋白。利用非融合表达产品制备抗血清,检测融合表达的重组蛋白,Western-blot为阳性。     

乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)高表达质粒的构建

我们利用了外切酶剪切,人工接头平端连接等DNA重组技术将HBcAg基因片段插入乳糖启动子下游的β-半乳糖苷酶结构基因中,获得了能高效表达HBcAg的重组质粒。ELISA方法检测表明,转化的大肠杆菌每毫升培养物含一万酶联免疫反应单位。